巧光泽灭基团。所述 探针乙的5'末端具有巧光报告基团，3'末端具有巧光泽灭基团。所述巧光报告基团具体可 为肥X，所述巧光泽灭基团具体可为肌Ql。
[0047] 所述试剂盒乙还包括内控质粒;所述内控质粒为如下(fl)或(f 2):
[004引（fl)含有序列表的序列10自5'末端第136-212位核巧酸所示的DNA分子的重组质 粒；
[0049] (f2)含有序列表的序列10所示的DNA分子的重组质粒。
[0050] 所述(fl)或(f2)中，所述重组质粒的出发质粒具体可为PCU57载体。
[0051] W上任一所述试剂盒还可包括PCR预混液和/或2 X PCR缓冲液和/或酶混液和/或 DEPC 水。
[00对 2 X PCR缓冲液：溶剂为pH8.0、50mM的Tri S-HCl缓冲液；溶质及其浓度为： dNTP2.5mM(指的是dATP、dTTP、dCTP、dGTP均为2.5mM)、MgCl巧OmM。
[0化3] 将12.5化的2 X PCR缓冲液、引物1、引物2、引物3、引物4、探针甲和探针乙混合，得 到20化PCR预混液。2化L PCR预混液中，引物1的含量为0.祉mol，引物2的含量为0.祉mol， 引物3的含量为0.8皿〇1，引物4的含量为0.8皿〇1，探针甲的含量为0.4皿〇1，探针乙的含量 为0.化mol。
[0化4] 酶混液中含有AMV反转录酶和AMV-Optimized Taq聚合酶。
[0化日]酶混液具体可为化kara公司，货号为RR024A的产品。
[0056]本发明还保护所述试剂盒甲或所述试剂盒乙在在检测人基因组DNA中是否发生了 引起MET基因 14外显子跳跃缺失的突变的应用。
[0化7] 本发明还保护一种检测人基因组DNA中是否发生了引起MET基因 14外显子跳跃缺 失的突变的方法，包括如下步骤：
[0058] (1似待测患者的总RNA为模板，采用所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物 4、所述探针甲和所述探针乙进行实时巧光定量PCR;所述实时巧光定量PCR的反应体系中含 有反转录酶；
[0059] (2)对PCR扩增结果进行判断，判断方法为：如果巧光报告基团乙相应的巧光信号 的Ct值^ 29,代表实验失败;如果巧光报告基团乙相应的巧光信号的Ct值<29,按照如下标 准进行判断:如果巧光报告基团甲相应的巧光信号的Ct值<39,结果为阳性，待测患者基因 组DNA中发生或疑似发生引起MET基因 14外显子跳跃缺失的突变;如果巧光报告基团甲相应 的巧光信号的Ct值>39或无 Ct值，结果为阴性，待测患者基因组DNA中没有发生引起MET基 因14外显子跳跃缺失的突变。
[0060] 本发明还保护一种检测待测样本是否存在引起MET基因 14外显子跳跃缺失的突变 的方法，包括如下步骤：
[0061 ] (1)提取待测样本的RNA，反转录为cDNA。
[0062] (2似步骤（1)得到的cDNA为模板，采用所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引 物4、所述探针甲和所述探针乙进行实时巧光定量PCR。
[0063] (3)对PCR扩增结果进行判断，判断方法为：如果巧光报告基团乙相应的巧光信号 的Ct值^ 29,代表实验失败;如果巧光报告基团乙相应的巧光信号的Ct值<29,按照如下标 准进行判断:如果巧光报告基团甲相应的巧光信号的Ct值<39,结果为阳性，待测患者基因 组DNA中发生或疑似发生引起MET基因 14外显子跳跃缺失的突变;如果巧光报告基团甲相应 的巧光信号的Ct值>39或无 Ct值，结果为阴性，待测患者基因组DNA中没有发生引起MET基 因14外显子跳跃缺失的突变。
[0064] 人基因组DNA中发生了引起MET基因 14外显子跳跃缺失的突变后，转录得到的RNA 具有序列表的序列2自5'末端第3018-3129位所示的核巧酸。人基因组DNA中MET基因转录得 到的RNA具有序列表的序列1自5'末端第3018-3270位所示的核巧酸。人基因组DNA中发生了 引起MET基因 14外显子跳跃缺失的突变后，转录得到的RNA如序列表的序列2所示。人基因组 DNA中MET基因转录得到的RNA如序列表的序列1所示。
[0065] W上任一所述待测样本具体可为新鲜病理组织、石蜡包埋组织或胸腔液。
[0066] W上任一所述巧光定量PCR的反应体系具体可为:将20化PCR预混液、1化酶混液 和化L步骤1得到的总RNA混合。
[0067] W上任一所述巧光定量PCR的反应程序具体可为:50°C反应30min，l个循环;94°C 反应2min，1个循环;94 °C反应30s，58 °C反应30s，共44个循环。
[0068] 本发明提供了一种快速廉价、操作简便的MET14外显子剪接突变检测试剂盒及检 测方法。本发明建立的方法操作简单，检测时间短，只需要直接加入提取好的样本RNA即可， 反转录和PCR扩增在封闭的同一反应体系中进行，降低了污染几率，同时降低了结果出现偏 差的几率，一次检测只需90分钟完成。本方法同时具备了灵敏度高，特异性好，安全无毒，成 本低等显著优点，可W满足临床快速检测的实际需求。
【附图说明】
[0069] 图1为阳性质控质粒及内控质粒扩增曲线图
[0070] 图2为灵敏度检测结果图
[0071] 图3为特异性检测结果图
[0072] 图4为临床样本S13(阳性结果)的扩增曲线图 [007引图5为临床样本Sl(阴性结果)的扩增曲线图
【具体实施方式】
[0074] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。W下实施例中的定量试验，均设置=次重复实验，结果取平 均值。
[00巧]POJ57载体:金斯瑞生物科技，货号SDl 176。
[0076] 人MET基因转录得到的RNA如序列表的序列1所示。人MET基因14外显子跳跃缺失后 转录得到的RNA如序列表的序列2所示。即人MET基因发生14外显子跳跃缺失后，其转录得到 的RNA缺失了序列1自5 '末端第3078-3218位核巧酸。
[0077] 实施例1、检测方法建立
[0078] -、设计引物及探针
[0079] 1、经过大量预实验和效果验证，得到特异引物对甲和特异探针甲。
[0080] 特异引物对甲由引物1和引物2组成。
[0081 ]引物1(序列表的序列3) :5'-CACTGTTATTACTACTTGGGT-3' ；
[0082] 引物2(序列表的序列4) :5'-AGAGGATACTGCACTTGTCG-3' ；
[0083] 探针甲的核巧酸序列如下（序列表的序列5): 5 ' -AAGAGAAAGCAAATTAAAGATCAGT-3'；
[0084] 探针甲的5'末端具有巧光报告基团FAM，3'末端具有巧光泽灭基团B册1。
[0085] 2、选择人ACTB基因作为内控基因，经过预实验和效果验证，得到特异引物对乙和 探针乙。
[0086] 特异引物对乙由引物3和引物4组成。
[0087] 引物3(序列表的序列6) :5'-GTCCACCTTCCAGCAGATG-3' ；
[008引 引物4(序列表的序列7) :5'-CCTAGAAGCATTTGCGG-3' ；
[0089] 探针乙的核巧酸序列如下（序列表的序列8): 5 ' -GCAAGCAGGAGTATGACGAGTCCGG-3'；
[0090] 探针乙的5'末端具有巧光报告基团HEX, 3'末端具有巧光泽灭基团肌Q1。
[00川二、制备试剂盒
[0092] 试剂盒由W下组分组成：
[0093] (I)PCR 预混液
[0094] 2 X PCR缓冲液：溶剂为pH8.0、50mM的Tri S-HCl缓冲液；溶质及其浓度为： dNTP2.5mM(指的是dATP、dTTP、dCTP、dGTP均为2.5mM)、MgCl巧OmM。
[0095] 将12.5化的2 X PCR缓冲液、引物I