一种用于叉头转录因子o1基因突变检测的试剂及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学及临床分子诊断技术领域，特别是设及一种用于叉头转录 因子Ol(FOXOl)基因突变检测的试剂、PCR检测方法及应用。
【背景技术】
[0002] Wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高 度保守的信号通路。Wnt信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过程 中，具有至关重要的作用。如果运条信号通路中的关键蛋白发生突变或者异常表达，导致信 号异常活化，就可能诱导癌症的发生。Wnt信号通路包括经典的Wnt信号通路与非经典的Wnt 信号通路，在经典通路即Wnt-0-catenin信号通路中，Wnt因子通过激活细胞膜上的 F;rizzle/LRP5/6协同受体后抑制细胞内游离0-catenin蛋白的憐酸化和降解，细胞质中的 0-catenin蛋白水平升高后将发生0-catenin蛋白的核移位，导致细胞核中0-catenin蛋白 升高，胞核中e-catenin蛋白能够联合巧go2、Bd-9W及化xMl蛋白共同与TCF/LEF-1转录因 子家族形成复合体并激活Wnt信号通路下游祀基因的转录激活。
[0003] FOXO1蛋白是Wnt信号通路中0-caten in下游重要成员之一。研究发现，在氧化应激 状态下，FOXOs能够竞争性地与0-catenin结合，减少后者与TCF的结合，从而影响Wnt信号通 路的传导。目前越来越多的研究已经发现，在很多肿瘤中FOXOl蛋白均呈现不同程度的突 变。
[0004] 目前研究核屯、信号通路的核屯、分子调控机制，W及某些重要成员在细胞中的表达 水平，已经成为治疗肿瘤的一种关键手段。近年来Wnt信号通路在癌症中的研究，W及FOXOl 蛋白作为Wnt信号通路重要成员其突变水平的研究，已经成为研究开发肿瘤药物急需解决 的重要问题，尤其是在FOXOl转录激活结构域中发生的突变，对FOXOl蛋白发挥功能启动非 常重要的作用，例如在子宫内膜癌细胞中检测出R609CS突变，前列腺癌细胞中检测出D624N 突变等。
[0005] 肤核酸(peptide nucleic acids，PNA)是一类W多肤骨架取代糖憐酸主链的DNA 类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的 第S代反义试剂，是一种全新的DNA类似物，即W中性的肤链酷胺2-氨基乙基甘氨酸键取代 了DNA中的戊糖憐酸二醋键骨架，其余的与DNA相同，PNA可W通过Watson-化ick碱基配对的 形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA 之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA间的 杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂交能力远 优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶 和蛋白酶水解。
[0006] 本方法采用特异序列的PNA寡聚物作为探针。由于PNA是一种人工合成的核酸的类 似物，并且为非手性、不带电荷的分子，避免了寡核巧酸与其祀基因结合时因电荷相互排斥 所导致的杂交不稳定性，结合不易受杂交液离子强度的影响，从而显示出极强的杂交优势， 大大提高了检测灵敏度。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有技术中如何确定Wnt信号通路中核屯、的信号分子FOXOl 基因突变情况，W及如何解释核屯、分子FOXOl在肿瘤细胞中的突变水平变化的困难，提供了 一种检巧UWnt信号通路中FOXOl基因突变检测试剂、PCR检测方法及应用。
[0008] 本发明的目的是提供一种用于叉头转录因子01F0X01基因突变检测的试剂，包括 用于阻断野生型FOXOl基因扩增的野生型PNA序列、用于特异性扩增R609C、D624N突变型 FOXOl基因序列的一组引物对及突变型PNA巧光探针：
[0009] 所述检测FOXOl基因 R609C突变正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1;
[0010] 所述检测FOXOl基因 R609C突变反向引物如序列表中沈Q ID NO.2;
[00川所述检测FOXOl基因 D624N突变正向引物如序列表中沈Q ID NO.3;
[001^ 所述检测FOXOl基因 D624N突变反向引物如序列表中沈Q ID NO.4;
[0013] 所述检测FOXOl基因 R609C突变PNA巧光探针如序列表中SEQ ID NO.5;
[0014] 所述检测FOXOl基因 D624N突变PNA巧光探针如序列表中SEQ ID NO.6;
[0015] 所述特异性结合包含FOXOl基因609密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.7；
[0016] 所述特异性结合包含FOXOl基因624密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.8；
[0017] 所述PNA巧光探针的5'端的巧光报告基团为:FAM、皿乂^61\1〇6、￥1(：、1?0乂、切3或 〔75,3'端的泽灭基团为：14134、6。11986、8册1、8册2、8册3或048(：化。
[0018] 本发明所述的检测试剂还包括PCR反应液、609密码子和624密码子突变型参考品、 609密码子和624密码子野生型参考品，其中PCR反应液包括:DEPC水、具有5 ' 一3 '外切活性 的DNA聚合酶、dNTPs、10 X PCR Buffer、RNASIN、M-MLV逆转录酶、01 igo (肌)和含Mg离子的溶 液。
[0019] 所述609密码子突变型参考品为含SEQ NO.9的重组质粒DNA;
[0020] 所述609密码子野生型参考品为含SEQ NO. 10的重组质粒DNA;
[0021] 所述624密码子突变型参考品为含SEQ NO. 11的重组质粒DNA;
[0022] 所述624密码子野生型参考品为含SEQ NO. 12的重组质粒DNA;
[0023] 所述具有5 ' 一3 '外切活性的DNA聚合酶为化q酶；
[0024] 所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中的终浓度为：Taq酶0.0 IU/化~ 0.0抓AiUdNTPs 0.2~0.6mM，10XPCR Buffer IX ,RNASIMOU/化~60UAiL，M-MLV逆转录 酶20011/化~3201]/化，]\%(：12 1.5~5.01111，溶剂为肥?(：水。
[0025] 具体地，所述正向引物的终浓度为0.05~0.9測，所述反向引物的终浓度为0.05~ 0.9咖，所述oligo(dT)终浓度为0.05~0.9測，所述互补PNA序列终浓度为0.05~0.9咖，所 述巧光探针的终浓度为0.05~0.9iiM。
[0026] 本发明所述的试剂进行实时巧光定量PCR的反应程序为:42°C逆转录20min;94°C 预变性，2min; 95 °C变性，30s，58 °C，45s川欠集巧光），进行40个循环。
[0027] 本发明的原理是通过构建与FOXOl基因野生型互补的一段肤核酸PNA序列，当肤核 酸PM序列与FOXOl基因互补结合时，任一突变均可导致PNA/DNA产生错配，从而使得溶解溫 度发生改变。进而根据FOXOl基因突变型设计特异性的肤核酸PNA探针W及引物对FOXOl突 变型基因进行巧光定量PCR扩增，经过一轮的PCR扩增后，即可将FOXOl基因突变型与野生型 进行区分开来。
[0028] 进一步地，本发明还提供了所述的试剂在制备检测癌细胞的检测试剂中的应用， 所述癌细胞为宫内膜癌、前列腺癌。
[0029] 与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：FOXOl基因是Wnt信号通路中0-catenin蛋白上游发挥着重要功能的基因，本发明提供了直接检测Wnt信号通路中FOXOl基 因突变检测的试剂，借助于所述检测试剂能够通过实时巧光定量PCR法在转录水平快速检 测出FOXOl基因的突变，而与普通实时巧光定量PCR不同的是，本发明设计野生型PNA序列， 可有效抑制野生型基因组扩增，只富集突变型基因扩增，大大提高了检测特异性，我们使用 的突变型PNA巧光探针更加灵敏，本发明为抗癌药物的筛选，新祀向药物的机制研究都提供 了非常有力的工具。
[0030] 同时本发明的实验体系可W在任何一台实时巧光定量PCR仪器上进行，上述引物 置于八联管中，进行实时巧光定量PCR检测，实验操作简单，费用低廉，结果重复性，敏感性 好，是研究肿瘤相关药物作用机理及基础科学研究的一种重要手段。
【附图说明】
[0031 ]图1是本发明实施例中所述肤核酸质谱图；
[0032] 图2是样品、R609C突变型和野生型参考品PCR扩增图；
[0033] 图3是样品、D624N突变型和野生型参考品PCR扩增图；
【具体实施方式】
[0034] 通过W下详细说明结合附图可W进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施 例仅是对本发明方法的说明，而不W任何方式限制本发明掲示的其余内容。
[0035] 本发明通过子宫内膜癌细胞进行举例说明，但是本发明不局限于子宫内膜癌细 胞，本发明所述检测试剂还可W应用于前列腺癌。
[0036] 实施例中的有关DNA和RNA基本操作均参考《分子克隆：实验室操作指南》(金冬雁 等译，科学出版社，北京（1998))和《精编分子生物学指南》（颜子译，科学出版社，北京 (1998))。
[0037] 本发明中IsWkawa(人子宫内膜癌Ish化awa细胞系)购自美国ATCC，培养细胞所使 用的RPMI-1640培养基及10%胎牛血清均购自英俊公司，其他试剂主要购自宝生物工程(大 连)有限公司。
[0038] 【实施例1】引物探针设计
[0039] 根据美国国家生物技术信息中屯、（National Center for Biotechnology Information，NCBI) (http : //www. ncbi . nlm. nih . gov)报道的FOXOl mRNA序列（NCBI Ref erence Sequence : NM_002015.3)，使用Appl ied Biosystems公司开发的Primer Express Software for Real-Time PCR软件设计特异的FOXOl引物与探针。
[0040] FOXOl R609C：
[0041 ] FOXOl-F: 5' -CCTTCTCCACCAGGAGAAGCTC-3';(沈Q NO. I)
[0042] FOXOI-R: 5' -CTTGACACTGTGTGGGAAGCTT-3';(沈Q NO. 2)
[0043] 突变型尸0乂01。臟）斗：5,施-167^41764616(：7^64(：-8册3'；（沈9^.5)
[0044] 野生型F0X01-PNA: 5 ' -TGTTCATTGAGCGCTTAG-3 ' ；（SEQ NO. 7)
[0045] 突变型祀序列：
[0046]
[0化引 W上:F:fo;rward，正向;FOXOl-F表示用于检测核酸的正向引物。
[0化9] R:reverse，反向;FOXOl-R表示用于检测核酸的反向引物。
[0060] P:probe，巧光探针;FOXOl-P表示用于检测核酸的巧光探针，该巧光探针为化qMan 巧光探针。
[0061 ]在本发明实施例中，修饰巧光探针的5 '端的巧光报告基团可W为:FAM，皿X，TET， 106，￥1(：，1?0乂，切3或切5;修饰巧光探针的3'端的泽灭基团可^为^411?4,6。11936,8朋1， B册2，BHQ3或DABCTL，该巧光报告基团与泽灭基团不影响巧光定量PCR的扩增，只需根据探 针的