橡胶树转录因子HbZNF1基因及其应用
【专利摘要】本发明涉及橡胶树转录因子HbZNF1基因及其应用。本发明属于林木抗逆生理学领域，具体涉及一种与橡胶树抗旱相关的转录因子基因及其应用。该基因为橡胶树锌指家族转录因子基因HbZNF1，其序列如图1所示。拟南芥转化的功能分析表明提高了转基因拟南芥的耐旱能力，可用于橡胶树和其他作物的抗逆转基因应用。该抗逆基因来自橡胶树，对环境影响较小。
【专利说明】
橡胶树转录因子HbZNFI基因及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及橡胶树转录因子HbZNFI基因及其 应用。
【背景技术】
[0002] Dof(DNA_binding One Finger)是植物转录因子家族的一个家族，属于C2H2类锌 指蛋白家族。第一个Dof转录因子是在玉米中筛选叶片文库中发现的，该转录因子通过结合 靶标基因启动子序列AAAG元件调控高低等植物种子成熟、萌发、生长、生物和非生物逆境响 应等重要生理过程。其与其他转录因子蛋白结合是调控植物多样性反应的重要机制。我国 橡胶树种植由于地处热带北缘，经常性受到干旱、寒害、台风等非生物胁迫，在橡胶树抗逆 品种选育和配套栽培措施研究中取得的基础上，采用分子生物学技术，尤其转录调控机制 研究橡胶树抗逆的分子机制将有助于研发与抗逆能力相关的分子标记辅助抗逆育种和研 发栽培技术。
[0003] 最近从橡胶树酵母双杂文文库中筛选到中Dof类转录因子HbZnFl，并证明其受干 旱、ΑΒΑ等激素上调表达，与下游转录因子HblMYC3启动子区域的AAAG基序结合，但其表达规 律与HblMYC3并不一致，推测其通过结合多种蛋白或调控多种橡胶树逆境响应基因表达，参 与橡胶树抗逆生理过程。D0F在高等植物中参与许多重要过程，包括光响应、激素、种子成熟 与萌发。D0F转录因子最早在玉米中被发现，将拟南芥、短柄草、大豆和小麦等D0F蛋白的结 构域进行聚类，分为6个组，每组的保守序列分别为GGTLRNVPVGGGCRK，TRGGALRNVPV， LRPHHQNQQALK，IRPGSMADRARMAKI，ARPVIERRARPQKDQA和ASPVLQANPAALSRSLNFHETS』OF结合 靶标基因启动子的AAAG序列(发向互补序列CTTT)，结合与高度保守的D0F结构域有关。根据 靶标基因的不同，D0F激活或者抑制转录，其在高等植物的多种组织中表达，甚至冗余。如， AtD0F4.7在拟南芥花器官中对PGAZAT基因起抑制作用，它还可以与其它转录因子AtZFP2结 合，共同起抑制作用。D0F也是激素信号途径的主要转录因子，AtDof3.6既受与生长发育相 关的生长素调控，又受次生代谢相关的水杨酸和茉莉酸调控。D0F还与bHLH转录因子结合参 与植物的光响应过程，例如，DAG 1受bHLH转录因子PIL5调控从而负调控赤霉素合成基因 AtGA3oxl。随着全基因测序的深入，除了模式植物外，相继在蔬菜胡萝卜、西红柿、水果香蕉 和牧草苜蓿中鉴定了 D0F转录因子成员。除了生长发育外，D0F在植物逆境分子响应研究中 亦占有重要地位，在白菜中、与橡胶树同属大戟科的麻疯树均证明D0F在逆境中具有重要作 用。因此，研究D0F类转录因子在逆境中的转录调控机制，尤其是其与其他转录因子蛋白结 合调控逆境响应将有助于阐明D0F转录因子在逆境信号途径中的作用机制。HbZNFI是在巴 西橡胶树品种热研7-33-97叶片中克隆的D0F转录因子，其序列由发明人注册，尚未公布。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供橡胶树转录因子HbZNFI基因及其编码蛋白。
[0005] 本发明的另一目的是提供橡胶树转录因子HbZNFI基因在提高植物抗旱能力中的 应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明从巴西橡胶树品种热研7-33-97叶片中克隆获得橡 胶树转录因子HbZNFl基因，HbZNFl基因的cDNA序列为：
[0007] i)SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列；或
[0008] ii)SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且 表达相同功能蛋白质的核昔酸序列;或
[0009] iii)在严格条件下与SEQ ID NO: 1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸 序列，所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C 下杂交，并用该溶液洗膜;或
[0010] iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的 核苷酸序列。
[0011] 测序结果表明，橡胶树转录因子HbZNFl为锌指T0F家族转录因子，HbZNFl基因开放 阅读框全长为969bp，编码由322个氨基酸组成的蛋白（SEQ ID N0:2)。通过对HbZNFl基因的 生物信息学分析和受干旱等胁迫时的表达模式判断，该基因可能参与橡胶树等植物抗逆途 径。
[0012]本发明还提供含有所述橡胶树转录因子HbZNFl基因的表达盒。
[0013]本发明还提供含有所述橡胶树转录因子HbZNFl基因的载体。
[0014]携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转 化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998,Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和 Corey,1998,Plant Molecular Biology,2nd Edition)〇
[0015]本发明还提供含有所述橡胶树转录因子HbZNFl基因的工程菌、转基因细胞系。 [0016]本发明还提供所述橡胶树转录因子HbZNFl基因在提高植物(例如，拟南芥、橡胶树 等)抗旱能力中的应用。
[0017] 本发明还提供所述橡胶树转录因子HbZNFl基因在制备转基因植物中的应用。
[0018] 本发明还提供一种转基因植株的构建方法，包括以下步骤：
[0019 ] (1)提取橡胶树叶片中的总RNA，反转录得到cDNA第一链；
[0020] (2)以cDNA第一链为模板，HbZNFl-F和HbZNFl-R为引物，所用引物序列为:肋2陬1_ F:5' -CCACCTTGAAACTCTTCTTTTCTTT-3' ;HbZNFl-R:5' -TTCCACTACAAACATAAGTGACCAA-3';通 过PCR扩增反应获得转录因子HbZNFl基因的cDNA序列，并将其cDNA片段连接至pMD 18-T载体 中并转化大肠杆菌DH5a菌株中进行克隆和测序验证，测序验证正确的质粒命名为HbZNFl-18T；
[0021] (3)以HbZNFl-18T质粒为模板，HbZNFl-OE-Fj'-CGGAATTCATGCCATCGATAAGTI' (下划线为 EcoR I 酶切位点）和 HbZNFl-OE-Rj' -CGGGATCCCTAGATCAGAGAAGT-3,(下划线为 BamHI酶切位点）为引物，，扩增HbZNFl基因的0RF，扩增产物经EcoR I和BamHI双酶切后连接 至经相同酶切后的表达载体，利用电击法将带有HbZNFl基因0RF的质粒转化农杆菌GV3101 菌株；
[0022] (4)利用转基因技术将带有HbZNF 1基因的农杆菌转化目标植物，获得转基因稳定 遗传植株。
[0023]其中，步骤（3 )中使用的表达载体为改造的pGreen Π 载体（购自Biovector 11^.1^六，商品编号：8丨〇代(^(^0800〇]〇，即在原载体骨架的3?61和乂匕&1位点之间插入 mGFP-6XHis片段。
[0024]本发明进一步提供橡胶树转录因子HbZNFl基因的荧光定量PCR检测引物，引物序 列如下：
[0025] HbZNFl-QF：57-TGCTTTCCTCTAGCTTTCAC-37
[0026] HbZNFl-QR：57-AGAGATCCCGGATTCACTAT-37
[0027] 分别检测橡胶树叶片、胶乳、树皮和花四种组织，经过干旱、机械伤害、脱落酸、赤 霉素和水杨酸处理后橡胶树叶片HbZNFl基因的表达情况，结果表明，HbZNFl基因受干旱、机 械伤害、脱落酸和水杨酸处理诱导表达。
[0028]本发明通过对HbZNFl基因转化拟南芥进行该基因的功能研究，验证了转基因拟南 芥对干旱胁迫的耐受能力得到提高。该基因可用于橡胶树和其他作物的抗旱转基因研究 中。本发明与橡胶树抗旱相关的转录因子基因 HbZNFl来自橡胶树，不会产生基因漂移，对环 境影响较小，为提高植物抗旱性提供新的基因资源。
【附图说明】
[0029]图1为本发明实施例1中HbZNF 1与蓖麻、葡萄等T0F家族转录因子保守区的氨基酸 序列同源性比对结果。
[0030] 图2为本发明实施例2中利用荧光定量PCR检测橡胶树受干旱、机械伤害、水杨酸、 脱落酸和赤霉素处理后，HbZNFl基因的表达情况。
[0031] 图3为本发明实施例3中野生型(Col)和HbZNFl转基因拟南芥株系的表型比较。
【具体实施方式】
[0032]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 [0033] 实施例1橡胶树转录因子HbZNFl基因的克隆
[0034]利用RT-PCR技术从巴西橡胶树品种热研7-33-97叶片中克隆获得橡胶树转录因子 HbZNFl基因，具体方法如下：
[0035] 1、提取橡胶树叶片中的总RNA，反转录得到cDNA第一链。
[0036] 2、以cDNA第一链为模板，HbZNFl-F和HbZNFl-R为引物，通过PCR扩增反应获得转录 因子HbZNFl基因的cDNA序列。
[0037]引物序列如下：
[0038] HbZNF1-F：57-CCACCTTGAAACTCTTCTTTTCTTT-37
[0039] HbZNFl-R^7 -TTCCACTACAAACATAAGTGACCAA-37
[0040] 使用2XTaq PCR MasterMix(天根生化)进行PCR扩增，反应体系为：cDNA模板2yL， 引物F、R(10ymol/L)各lyL，2XPCR MasterMix 25yL，加 ddH20至50yL。
[0041 ] PCR 扩增程序为：94°C 变性 3min; 94°C 变性 30s，55 °C 退火 50s，72 °C 延伸 2min，共 35 个循环;最后72°C延伸10min。
[0042] 3、扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，凝胶回收纯化，并克隆到 PMD18-T载体上，经菌落PCR检测，送上海立菲生物技术有限公司进行测序验证，测序验证正 确的质粒命名为HbZNFl-18T。测序结果表明，橡胶树转录因子HbZNFl属于T0F家族转录因 子，HbZNFl基因 cDNA序列（SEQ ID N0:1)为 1184bp;其0RF(开放阅读框）为969bp(SEQ ID NO:3)，编码由322个氨基酸组成的蛋白HbZNFl(SEQ ID NO:2)。
[0043] HbZNFl与蓖麻、葡萄等TOF家族转录因子保守区的氨基酸序列同源性比对结果见 图1。
[0044] 实施例2 HbZNFl基因受干旱等胁迫时的表达分析
[0045] 采用荧光定量PCR方法检测橡胶树叶片、胶乳、树皮和花四种组织，经过干旱、机械 伤害、水杨酸、脱落酸和赤霉素处理后橡胶树叶片HbZNFl基因的表达情况。
[0046]干旱处理:先将热研7-33-97芽接苗浇水至饱和，然后放在光照培养箱进行断水处 理，连续采集〇-l〇d叶片为材料。
[0047] 机械伤害处理:采用镊子夹伤热研7-33-97叶片，在0、0.5、1、2、6和12h采取叶片样 品，以未处理的植株作为对照。
[0048]化学药剂处理：以巴西橡胶树无性系CATAS7-33-97芽接苗为材料，分别喷施200μΜ 脱落酸(ABA)、5mM水杨酸(SA)和3mM赤霉素(GA3)，分别在0、0.5、2、6、10、24、48和72h采取叶 片样品，所有药剂用〇.05%乙醇进行溶解，对照植株喷施0.05%乙醇水溶液。
[0049] 根据HbZNFl基因序列设计如下荧光定量PCR检测引物：
[0050] HbZNFl-QF：57-TGCTTTCCTCTAGCTTTCAC-37 [0051 ] HbZNFl-QR：57-AGAGATCCCGGATTCACTAT-37
[0052] HbACTIN-F：57-GATGTGGATATCAGGAAGGA-37
[0053] HbACTIN-R：57-CATACTGCTTGGAGCAAGA-37
[0054] 以HbACTIN(GenBank登录号：H0004792)为内参基因。使用BioRad公司的CFX-96荧 光定量PCR仪进行荧光定量PCR，反应程序为:95 °C预变性30s; 94 °C 5s，60 °C 20s，72 °C 20s，进 行45个循环。扩增结束后绘制熔解曲线，从50°C逐渐升温至95°C，升温速度0.2°C/s，全过程 检测荧光信号。HbZNFl基因的表达量采用公式Qt = 2-Ct(HbACTIN)-Ct(HbZNFl)计算，Ct表 示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
[0055] 荧光定量PCR检测结果表明，橡胶树受干旱、机械伤害、脱落酸和水杨酸处理后， HbZNFl基因诱导表达（图2)。
[0056] 实施例3转HbZNFl基因拟南芥植株的获得及抗旱鉴定
[0057] 以实施例1制备的HbZNFl-18T质粒为模板，HbZNFl-OEU'-CGGAATTCATGCCATCGATAAGT-37 (下划线为EcoR I酶切位点）和HbZNFl-〇E-R : 5'-CGGGATCCCTAGATCAGAGAAGT-37 (下划线为BamHI酶切位点）为引物，扩增HbZNFl基因的0RF， 扩增产物经EcoR I和BamHI双酶切后连接至经相同酶切后的表达载体(改造的pGreen Π 载 体，即在原载体骨架的SpeI和Xbal位点之间插入mGFP-6 X His片段），构建好的重组质粒命 名为HbZNFl-〇E-GFP，利用电击法将重组质粒HbZNFl-〇E-GFP转化农杆菌GV3101菌株;通过 农杆菌介导法将HbZNFl基因转化到野生型拟南芥植株(Co 1)中进行过表达，对转基因阳性 植物进行鉴定，对含目标基因的T3代阳性植株进行筛选及抗逆分析，结果表明过表达 HbZNFl基因的转基因拟南芥对干旱胁迫的耐受能力明显提高，为HbZNFl基因在其他植物上 的应用提供良好的基础。与野生型(Col)拟南芥植株相比，HbZNFl转基因株系的根系发达， 土壤中的耐旱性明显提高(表1和图3)。
[0058] 表1野生型和转HbZNFl基因拟南芥植株的表型比较
[0060]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 橡胶树转录因子HbZNFl基因，其特征在于，HbZNFl基因的cDNA序列为： i) SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；或 ii) SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达 相同功能蛋白质的核昔酸序列;或 iii) 在严格条件下与SEQ ID NO: 1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序 列，所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下 杂交，并用该溶液洗膜;或 iv) 与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷 酸序列。2. 权利要求1所述橡胶树转录因子HbZNFl基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列 如SEQ ID NO:2所示。3. 含有权利要求1所述橡胶树转录因子HbZNFl基因的表达盒。4. 含有权利要求1所述橡胶树转录因子HbZNFl基因的载体。5. 含有权利要求1所述橡胶树转录因子HbZNFl基因的工程菌。6. 权利要求1所述橡胶树转录因子HbZNFl基因在提高植物抗旱能力中的应用。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物包括拟南芥、橡胶树。8. 权利要求1所述橡胶树转录因子HbZNFl基因在制备转基因植物中的应用。9. 一种转基因植株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取橡胶树叶片中的总RNA，反转录得到cDNA第一链； (2) 以cDNA第一链为模板，HbZNFl-F和HbZNFl-R为引物，通过PCR扩增反应获得转录因 子HbZNFl基因的cDNA序列； (3) 利用电击法将带有HbZNFl基因 cDNA序列的质粒转化农杆菌； (4) 利用转基因技术将带有转化质粒的农杆菌转化目标植物，获得转基因稳定遗传植 株； 其中，步骤⑵所述引物F和R的序列如下： HbZNFl-F:5'-CCACCTTGAAACTCTTCTTTTCTTT-37 HbZNFl-RiS7-TTCCACTACAAACATAAGTGACCAA-37 〇10. 权利要求1所述橡胶树转录因子HbZNFl基因的荧光定量PCR检测引物，其特征在于， 引物序列如下： HbZNFl-QF:5'-TGCTTTCCTCTAGCTTTCAC-3' HbZNFl-QRj7 -AGAGATCCCGGATTCACTAT-3'。
【文档编号】A01H5/00GK105950631SQ201610338944
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】王立丰, 王纪坤, 安锋, 谢贵水
【申请人】中国热带农业科学院橡胶研究所