花生MYB类转录因子AhMYB31及应用
【技术领域】
[0001] 本发明公开了花生MYB类转录因子AhMYB31及其应用，属于生物基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 禽成髓细胞瘤病毒致癌基因同源物类（v-mybavianmyeloblastosisviral oncogenehomolog,MYB)转录因子家族是一类含MYB结构域的转录因子，是植物转录因子 中数量最多、功能最多样化的一个家族。结构域是一段约51~52个氨基酸的肤段， 且每隔18~19个氨基酸就有一个保守的色氨酸残基，它们参与空间结构中疏水核屯、的形 成，对于维持螺旋-转角-螺旋（HTHAelix-turn-helix)构型有特别重要的意义狂hong etal.，2007)。Paz-Ares等（1987)首次从玉米谷粒糊粉中克隆了C0L0RED1 (Cl)基因， 编码一个具有MYB结构域的蛋白，参与花青素合成。拟南芥基因组测序成功后，第一次全 面地对植物MYB基因家族进行描述和分类，为系统研究MYB转录因子家族在植物中的作用 打下良好基础（Strackeetal.，2001;Duetal.，2009)。根据所含肌B结构域的数目不 同，植物中的MYB转录因子大体上可W分为S类：1)只含一个MYB结构域的MYB蛋白亚类， 可能是一类重要的端粒结合蛋白，在维持染色体结构的完整性和调苄基因转录上起重要作 用（化ristianetal.，2010);2)R2R3亚类成员含两个结构域，它们主要参与次生代 谢调节、控制细胞的分化、应答激素的刺激W及抵御外界胁迫和病原菌的侵染（Matuset al.，2008) ;3)R1R2R3亚类成员含S个结构域，主要参与控制细胞周期和调节细胞分化 化agaetal. , 2007)
[0003] 目前已从许多植物中鉴定出多个肌B转录因子，其中又WR2R3型居多（Kranzet 曰1.，2000)，如拟南芥中已发现126个R2R3型成员（C虹istianet曰1.，2010)，玉米中该家 族成员有158个化aietal.，2012)。它们广泛参与植物次生代谢的调控、对激素和环境 因子的应答（Sugimotoetal.，2000)，并在细胞分化、器官的形成、植物叶片的形态建成及 抗病抗逆等方面具有重要的调控作用（Vailleauetal., 2002;Vanninietal., 2004;Du etal., 2009;Dubosetal., 2010;Felleretal., 2011;Czemmeletal., 2012)。目前， 其他作物中也相继有MYB类转录因子的报道，如甘馨（Manoetal.，2007)、棉花（房栋等， 2008)、大豆（李晓薇等，2011)等，但它们的具体功能还有待进一步的验证。花生中该类转 录因子鲜有报道，山东花生所化en等（2013)根据MYB结构域的保守性，利用生物软件对花 生已公布的36741条ESTs序列进行比对分析，获得了 30个具有完整ORF(开放阅读框）的 cDNA序列，命名为AhMYBl~30,结构域分析其中9个基因为R2R3型；1个基因为R1R2R3 型；其余为IR型或MYB-relate型，但具体功能分析未见报道。
【发明内容】
[0004] 技术问题
[0005] 本发明的目的在于提供一种调控植物耐盐性的花生转录因子基因AhMYB31。 [000引技术方案
[0007] 本发明提供一种调控植物耐盐性的花生MYB转录因子基因AhMYB31，所述基因 cDNA序列如沈QIDNO. 1所示。
[0008] 所述的调控植物耐盐性的花生MB转录因子AhMYBS12基因编码的蛋白质，具有序 列表中SEQIDNO. 2所述的氨基酸序列。
[0009] 本发明所述AhMYB31基因的应用。具体指AhMYB31基因具有转录自激活活性，将 其通过植物表达载体转入目的植物内，能提高植物的耐盐性。所述植物优选是模式植物拟 南芥。
[0010] 有益效果
[0011] 本发明公开了花生R2R3-M1^类转录因子基因AhMYB31及其所编码的蛋白质，该 基因在花生中为首次报道。巧光定量表达分析表明该基因受高盐胁迫诱导，AhMYB31表现 出高盐胁迫响应更为显著，在胁迫处理1化后上调了近2倍。试验表明AhMYB31转录因子 具有转录自激活活性，转拟南芥功能验证显示该基因的过量表达提高了拟南芥对高盐的抗 性。因此有望作为目的基因导入植物，提高植物耐盐性，从而进行植物品种改良。
【附图说明】
[001引图1 :PCR扩增后的凝胶电泳结果
[0013]注：图中M:DL2000marker;31 :AhMYB31
[0014] 图2 :qPCR分析AhMYB31基因在高盐和干旱下的表达情况
[0015] 图3 :AhMYB31基因的转录自激活活性验证
[0016] 注：图中A为阳性对照：pGBKT7+pGADT7巧为阴性对照：pGBKT7 ;C为 pG服 17-AhM1^31。
[0017] 图4 :MS培养基法鉴定AhMYB31拟南芥植株的耐盐性
[0018] 注：图A:萌发期耐盐性鉴定的对照培养基；图B:萌发期耐盐性鉴定的盐处理培 养基；图C:幼苗期耐盐性鉴定的对照培养基；图D:幼苗期耐盐性鉴定的盐处理培养基
[0019] 图5 ±培法耐盐性鉴定结果
[0020] 注：图（a)为对照诱清水处理；图化）为盐胁迫处理后
【具体实施方式】
[0021] 实施例1 :AhMYB31基因的获得
[0022] 选用花生较抗旱品种：丰花1号（鲁农审字巧001]017号，江苏省农业种质资 源中期库提供），光照培养箱中萌发生长，待生长至3叶期幼苗，进行干旱（20%PEG6000) 及高盐（1%化Cl)处理，处理24h后分别取部分叶片等量混合放入研鉢中，在液氮下快速 研磨成粉状，利用RNA提取试剂盒化Z.N.A.TMPlantRNAKit,购自OMEGA公司）提取样 品的总RNA，并用DNAseI进行消化处理。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性， NanoDrop-2000型分光光度计检测总RNA的浓度和纯度。再通过反转录试剂盒将总RNA反 转合成CDNA。
[0023] 根据花生抗旱耐盐相关转录组测序结果，挑选了差异表达的101条MYB相关序列， 去除部分重复序列，其余序列利用ORFFinder(ht1:p://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/ go计/)进行ORF分析，筛选出10个具有完整ORF的序列。分别根据运些预测序列的5和 3端的非编码区设计特异性引物，W上述花生抗旱耐盐的cDNA为模板，尝试不同PCR反应 条件后，最终仅扩增出4个预测序列，分别为AhMYB31-34。其中AhMYB31的PCR引物为PU P2 (表1)，反应条件为
[0024] 94°(：预变性5111111;94°(：变性3〇3,58-60°(：退火3〇3,72°(：延伸6〇3,35个循环； 72°C延伸lOmin。扩增出的目的片段经1%琼脂糖凝胶电泳检测（图1)，回收后连接到质 粒载体pGEM-T，然后转化大肠杆菌菌株JM109灯aKaRa)感受态细胞，经选择性LB培养基 (IPTG、X-gal、Amp)得到阳性克隆，菌液培养后测序分析。测得序列与预测序列一致，命名 为AhMYB31，AhMYB31的cDNA序列如沈QIDNO. 1所示，编码的蛋白序列如沈QIDNO. 2 所示；结构域分析显示其具有2个MYB-DNA结构域巧2、R3);系统进化树分析表明与拟南芥 的AtMYB60、30、31、96、94 亲缘关系近。
[002引表1:说明书中设及的引物相关信息
[0027] 实施例2 :AhMYB31基因的表达分析
[0028] 选用花生品种：丰花1号，光照培养箱中萌发生长，待生长至3叶期幼苗，分别进行 干旱（20%阳G6000)及高盐（1 %化Cl)处理，分别取化、地、化、1化的叶片样品，液氮冷冻 后，-80°C冰箱保存。再利用RNA提取试剂盒化Z.N.A.TMPlantRNAKit,购自OMEGA公 司）分别提取样品的总RNA，并反转成cDNA。
[0029] 基于AhMYB31序列设计定量引物P3、P4(表1)，W花生18SR