专利名称：水稻穗粒数调控基因OsNAC2及其表达系统和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种水稻穗粒数调控基因0sNAC2及其表达系统和应用。
背景技术：
水稻是世界上重要的粮食作物之一，其产量和品质的不断提高是育种工作的主要目标。穗粒数是水稻产量构成最重要的因素之一，国际水稻研究所把穗粒数多作为水稻理想株型的目标之一。因而，穗粒数相关基因的克隆和研究，不但对理解水稻穗型发育具有重要的意义，同时，对水稻育种具有非常重要的应用价值。NAC转录因子是近十几年来发现的具有多种生物功能的一类植物特有的转录因子。第一个 NAC 转录因子是由 Souer 等(Souer E, van Houwelingen A, Kloos D, Mol J, Koes R (1996). The No Apical Meristem gene of Petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordia boundaries. Cell 85，159 - 170.)从矮牵牛中克隆得到的，它影响矮牵牛顶端分生组织的形成与分化。Aida 等(Aida M, Ishida T, Fukaki H, Fujisawa H, Tasaka M (1997). Genes involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of cup-shaped cotyledonmutant. Plant Cell 9，841 - 857.)报道，NAC 结构域在矮牵牛似I、拟南芥 ATAF1/2和CZ/β 编码蛋白的N端都包含一段保守的氨基酸序列，取三基因首字母命名为 NAC0此后，人们就将含有NAC结构域的蛋白统称为NAC转录因子。水稻中有140多个NAC 成员，已有的研究表明，NAC蛋白参与植物生长发育和器官的模式建成，在植物信号转导以及非生物损伤和胁迫应答过程中，NAC作为转录因子起激活或抑制应答的功能。在侧根发育过程中，NAC基因参与调节侧根的形成和发育，拟南芥NACl基因主要在根尖和侧根生长原基表达，受IAA的诱导，能促进侧根的形成(Xie Q, Frugis G, Colgan D, Chua NH (2000). Arabidopsis NACl transduces auxin signal downstream of TIRl to promote lateral root development. Genes Dev 14，3024 - 3036.)。拟南芥的 AtNAC2 基因也在根中特异表达，并受到IAA的上调，能显著增加侧根数目(He XJ, Mu RL, Cao WH, Zhang ZG, Zhang JS, Chen SY (2005). AtNAC2, a transcription factor downstream of ethylene and auxin signaling pathways, is involved in salt stress response and lateral root development. Plant J 44, 903 - 916.)。植物开花受到多种逆境的影响，例如高盐和低温等，盐胁迫诱导NTL8的表达，并延迟开花；过表达NTL8蛋白的拟南芥出现生长缓慢及开花延迟的现象(Kim SG, Kim SY, Park CM (2007). A membraneassociated NAC transcription factor regulates saltresponsive flowering via FLOWERING LOCUST in Arabidopsis. Planta 226，647 - 654.)。拟南芥中近 1/5 (20/107)的 NAC基因与叶片衰老相关(Guo Y, Cai Z, Gan S (2004). Transcriptome of Arabidopsis leaf senescence. Plant Cell Environ 27，521 - 549.)。其中几个基因已被证实参与了衰老的调控过程。 最近从水稻和大麦(Hordeum vulgare)中同时鉴定出一个新的铁匮乏应答元件IDE2 (irondeficiencyresponsivecis-acting element 2)结合蛋白 IDEF2,它是NAC蛋白家族中的一
员O目前，没有发现与水稻穗粒数有关的NAC类转录因子。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的水稻穗粒数相关的NAC类转录因子尚未有研究，提供一种与水稻穗粒数相关的NAC转录因子0sNAC2。本发明另一目的在于提供上述0sNAC2基因编码的蛋白质。本发明另一目的在于提供包含上述0sNAC2基因的质粒。本发明另一目的在于提供包含上述质粒的表达载体。本发明另一目的在于提供包含上述表达载体的转基因植物细胞。
本发明还有一个目的在于提供上述0sNAC2基因的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
一种与水稻穗粒数相关的NAC转录因子，命名为0sNAC2，具体可如下
(1)其核苷酸序列如SEQID NO: 1或3所示;
(2)在SEQID NO: 1或3所示序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸生成突变体、等位基因或衍生物；
(3)在严格条件下可与SEQID NO: 1或3所限定的DNA序列杂交并且编码上述与水稻的穗粒数相关蛋白的DNA分子，其同源性最好为95%以上；
(4)与SEQID NO: 1或3所示的基因序列具有90%以上的同源性，并且编码与水稻穗粒数相关的DNA分子。本发明水稻穗粒数调控基因0sNAC2编码的蛋白质的氨基酸序列具体可以如下所示
(1)其氨基酸序列如SEQID N0:2所示;
(2)在SEQID N0:2所示序列中添加、取代、插入或缺失一个或者多个氨基酸所生成的衍生物。SEQ ID NO: 1由1401个碱基组成，自5，末端第105个碱基开始为编码区，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。SEQ ID N0:3由1401个碱基组成，编码序列为自5，端105碱基到1032碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。本发明所述的0sNAC2启动子也属于本发明的保护范围。0sNAC2基因启动子，是如下①或②的DNA分子
(1)其核苷酸序列如SEQID N0:4所示；
(2)在严格条件下可与如SEQID N0:4所示的DNA分子杂交具有启动子功能的DNA分子。上述的严格条件可为在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65 °C下杂交，然后用 2 XSSC,0. 1% SDS 和 1XSSC，0. 1% SDS 各洗杂交膜一次。扩增上述0sNAC2基因及其启动子全长或是任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
含有上述与水稻的穗粒数相关蛋白编码基因及其启动子的重组载体、转基因细胞系或是重组菌也属于本发明的保护范围。可用现在的植物表达载体构建含有0sNAC2基因及其启动子的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于将植物微蛋轰击的载体等，如PCAMBIA3301 、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301、pBI121或其他衍生植物表达载体。携带有本发明的与水稻的穗粒数相关蛋白编码基因0sNAC2及其启动子的植物表达载体可以通过Ti质粒、Ri质粒、 植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或是组织中。被转化的宿主植物可以是水稻。使用0sNAC2基因构建重组植物表达载体时，其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(Pubi)等，他们可单独使用或与其他的植物启动子结合使用； 此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可以使用增强子，包括翻译增强子或者转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或是邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构区域。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可以产生颜色变化的酶或是发光化合物的基因(如GUS基因、 荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除秀剂基因)等。本发明水稻穗粒数调控基因0sNAC2可用于改变水稻穗粒数。本发明所提供的改变水稻穗粒数的方法有两种，一种是将0sNAC2基因导入目的水稻组织或是细胞中，得到穗粒数改变的转基因水稻。另一种是沉默目的水稻中含有的 0sNAC2基因，得到穗粒数改变的转基因水稻。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明转0sNAC2基因实验结果表明，转0sNAC2基因植株表现为穗粒数增加，其蛋白质和编码基因对水稻穗粒数的调控具有重要的实际意义，在实际应用中可以将0sNAC2基因转入不同的水稻品种中，以培育更加理想的水稻栽培品种。0sNAC2蛋白及其编码基因在农业领域具有广阔的应用和市场前景。
图1经农杆菌介导得到的转化植株分化及生根；
图2转化植株外源基因PCR检测，泳道M为分子量标记DL2000 (购自TAKARA)； 泳道1为空白对照，泳道2为对照植株中花11，泳道3为阳性植株对照，泳道4-25为0sNAC2 基因转化植株；
图3转化植株与对照植株形态图，CK 对照植株；13-3 转化植株； 图4 转化植株与对照植株穗部特征图，CK 对照植株；13-3 转化植株。
具体实施方式
下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物合成及测序工作由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成。实施例 0sNAC2基因的获得
根据NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)提供的关于该基因的cDNA序列设计引物，引物序列如下(3-1234bp) NACF 如 SEQ ID NO:5 所示； NACR 如 SEQ ID NO:6 所示。以粳稻品种中花11号2周的幼苗cDNA为模版，在引物NACF和NACR的引导下，用常规方法扩增0sNAC2基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化大约1200bp左右的DNA片段，将该片段克隆到pMDIS-T载体(购自TAKARA公司)上， 获得pMD18-T-0sNAC2载体，送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，测序结果表明，该DNA片段的序列如如SEQ ID NO: 1所示；编码序列表中序列2所示的蛋白。根据序列表中序列1的核苷酸序列设计引物对NACEF和NACER，并在引物两端分别引入限制性内切酶/ZifldIII和分el识别位点和保护碱基，引物序列如下
NACEF 如 SEQ ID N0:7 所示aaaaaaagcttacaacgatttcctcttgtcacc (下戈丨」线为限制性内切酶WifldIII识别位点)
NACER如 SEQ ID NO:8所示aaaaaactagtgtagatgcctcgatcgcgatc (下划线为限制性内切酶分el识别位点)
以pMD 18-T-0sNAC2载体DNA为模版，在引物NACEF和NACER的引导下，用常规方法扩增0sNAC2基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化大约1200bp左右的DNA片段，将该片段克隆到pMDIS-T载体(购自TAKARA公司)上，获得 pMD18-T-0sNAC2-E载体，送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，测序结果表明，该DNA片段的序列如SEQ ID NO: 1所示，在其DNA两端引入了合适的没切位点；编码序列表中如SEQ ID N0:2所示的蛋白。根据序列表中如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列设计引物对MNACF2和MNACR2，引物序列如下
MNACF2 如 SEQ ID N0:9 所示； MNACR2 如 SEQ ID NO: 10 所示。以pMD18-T-0sNAC2-E载体DNA为模版，在引物NACEF和MNACR2的引导下，用常规方法扩增0sNAC2-F基因片段；在引物NACER和MNACF2的引导下，用常规方法扩增0sNAC2_R 基因片段，反应结束后，分别对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，分别回收并纯化大约 800bp 和 400bp 左右的 DNA 片段，即 0sNAC2_F 和 0sNAC2_R 片段，以 0sNAC2_F 和 0sNAC2_R 片段为模版，在引物NACEF和NACER的引导下，用常规方法扩增m0sNAC2基因全长，反应结束后，对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化大约1200bp左右的DNA片段， 将该片段克隆到PMD18-T载体上，获得PMD18-T-m0sNAC2载体，送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，测序结果表明，该DNA片段的序列如序列3所示，编码序列表中序列2所示的蛋白。将m0sNAC2基因克隆入植物表达载体pCAMBIA1380多克隆位点的历/ dIII和分el酶切位点之间，得到含有0sNAC2基因的植物表达载体，然后利用农杆菌介导的方法转化粳稻品种中花11号的成熟胚的愈伤组织，方法如下述文献描述周玲艳，姜大刚，吴豪等，基于TAC载体的水稻转化系统的建立.遗传学报，2005，32:514-518。经过预分化、分化，得到21株转化植株，图1，经过PCR鉴定，全部为阳性，PCR引物序列如下 引物1如SEQ ID NO: 11所示； 引物2如SEQ ID NO: 12所示。PCR 扩增条件为94 "C 2 min ；94°C 30 sec, 58 "C 30 sec, 72°C 1 min，35 个循环；72 V 5 min。反应结束，对扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示，阳性植株可以扩增得到约SOObp的条带。将经过PCR鉴定为阳性的转基因植株培养至成熟，观察不同时期的植株形态，结果如图3所示，所得到的21株植株皆表现出穗粒数明显增多的表型。转化植株与对照植株相比，在以下四个产量性状有明显变化一级枝梗数增加；二级枝梗数增加；主穗粒数增加；单株产量增加。图4显示的是一株转0sNAC2基因和一株对照植株的穗部图片。
权利要求
1.一种水稻穗粒数调控基因0SNAC2，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1或3所示。
2.根据权利要求1所述的水稻穗粒数调控基因0sNAC2，其特征在于其核苷酸序列还包括在序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸生成突变体、等位基因或衍生物；或者是在严格条件下可与SEQ ID NO: 1或3所示的序列杂交并编码与水稻的穗粒数相关蛋白的DNA分子；或者是与SEQ ID NO: 1或3所示的序列有90%以上的同源性，并编码与水稻的穗粒数相关蛋白的DNA分子。
3.权利要求1或2所述的水稻穗粒数调控基因0sNAC2编码的蛋白质，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求3所述的水稻穗粒数调控基因0sNAC2编码的蛋白质，其特征在于其氨基酸序列还包括在序列中添加、取代、插入或缺失一个或者多个氨基酸所生成的衍生物。
5.一种质粒，其特征在于所述包含权利要求1或2所述的水稻穗粒数调控基因 0sNAC2。
6.一种植物表达载体，其特征在于包含包含权利权利要求5所述的质粒。
7.—种转基因植物细胞，其特征在于包含权利要求6所述的植物表达载体。
8.权利要求1或2所述水稻穗粒数调控基因0sNAC2的应用，其特征在于所述0sNAC2 基因用于对水稻穗粒数进行改造。
9.根据权利要求8所述的水稻穗粒数调控基因0sNAC2的应用，其特征在于将0sNAC2 基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株；或者是沉默目的水稻种含有的 0sNAC2基因，得到穗粒数改变的转基因水稻。
全文摘要
本发明公开了一种水稻穗粒数调控基因OsNAC2及其表达系统和应用。本发明水稻穗粒数调控基因OsNAC2的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本发明水稻穗粒数调控基因OsNAC2的克隆有助于研究水稻穗发生发育的分子机制，对生产上培育具有优良株型结构的高产水稻品种，或是通过转基因的方法改良其它作物的高产株型结构具有很大的应用价值。
文档编号C12N15/63GK102485896SQ201010567349
公开日2012年6月6日 申请日期2010年12月1日 优先权日2010年12月1日
发明者姜大刚, 庄楚雄, 李静 申请人:华南农业大学