专利名称：一种利用双t-dna+1载体培育高效无选择标记转基因作物的方法
技术领域：
本发明设计一种高效无选择标记转基因农作物新方法的建立
背景技术：
粮食问题是社会和谐、稳定的重要物质基础，是每个国家关心的核心问题之一。解 决粮食安全问题是保障国民经济高效和可持续发展的必要前提。近几年，随着环境的恶化、 耕地面积的减少、人口的增长，中国的粮食问题面临着越来越大的挑战。单纯依靠传统的育 种方法已经不能解决越来越严竣的形势，因此利用基因工程手段改良农作物品种、提高作 物产量、培育优良的作物品种具有重要的意义。自1983年首例转基因植物培育成功，转基因技术得到了广泛应用。现在转基因植 物已扩展到包括经济作物、粮食作物、蔬菜、花卉、药用植物、水果、树木以及牧草等在内的 35个属、120多个物种。但是随着转基因作物商品化生产的加快，一些潜在的问题逐步浮现 出来，选择性标记对环境和食物的安全性问题是被广泛关注和讨论的问题。利用农杆菌介 导、基因枪等方法将外源基因转入到植物体内，通过选择性标记进行辅助筛选得到转入目 的基因德转基因阳性植株。但是，选择标记基因既非植物体内的基因也非目的基因，这种多 余的存在可能导致一些潜在危害，主要表现在1，目前的所用的选择标记基因多为抗生素 抗性基因，比如卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因等，这些标记随转基因产品商业化后， 转移到病原微生物中，人们担心会影响增强病原微生物的抗药性，导致抗生素的失效。2，有 些标记基因为除草剂抗性标记基因，如果带有该种抗性标记基因的转基因作物同近缘野生 杂草杂交，该抗性标记基因平行转移到杂草中，有可能会产生抗药性超级杂草，对农业生产 带来极大的危害。3，人们怀疑转基因的标记基因及其产物可能会对人或动物产生一定的危 害。4，标记基因漂移到环境中会打破生态平衡，对环境造成一定的危害。因此，建立高效高 通量无选择标记的转基因转化体系是现今植物转基因工程的重要目标和迫切任务之一，也 是全球植物育种学家关心的热点问题。目前，获得无选择标记转基因植株的方法主要有位点特异性重组、转座子系统以 及共转化系统，其中共转化系统是研究比较多、应用比较成熟的方法。位点特异性重组是 利用重组酶催化两个短的、特定DNA序列间的重组，剔除选择标记基因，从而获得无标记 基因的转基因作物。其原理是，把选择标记基因插在两个特异性重复序列之间，转化植 物后，再特异性表达特意位点重组酶基因，通过位点特异性重组剔除选择标记。现今在植 物基因工程中常用的位点特异性重组系统主要有，酵母FLPPFRTs位点特异重组系统， Zygosaccharomyces rouxii的RPRS系统，噬菌体Pl的CreP Iox系统，以及噬菌体Mu的 Gin重组酶系统。但是，利用该方法获得无选择标记的转基因植物，一般需要二次转化或有 性杂交获得重组酶，使无选择标记转基因作物的获得过程过于复杂，不利于转基因作物商 品化的发展。最近发展的可调控的位点特异性系统简化了无选择标记基因培育的过程，但 是其作用机理仍需要进一步研究，实际操作也有待提高。转座子系统能够利用专座酶从植物染色体上的一个位置转移到另一个位置，利用这种重组特性可以剔除转基因作物的选择 标记。AcPDs和SpmPdSpm是两个研究得最深入的转座子家族。但是，因为大多数被修饰过 的转座因子(如插入了 ipt基因)被切除后又会重新插入基因组中的其它位置，只有转座 失误的细胞才能形成表型正常的转基因作物。这种剔除选择标记基因的方法效率比较低， 在转基因作物的商品化过程中受到限制。最初共转化系统是指用两个独立的质粒，其中一 个含有选择标记基因，另一个含有目的基因，同时转化目的细胞，两个质粒可同时整合进植 物细胞，培育这种共同整合的转化植株后代，经过有性阶段的遗传重组，选择标记基因与目 的基因分离，从而得只含有目的基因而不带选择标记基因的转化植株。共转化系统要求共 转化频率要高而且共转化的DNA在受体细胞中处于不连锁状态.。实际操作中，位于不同转 化载体中的转基因共整合频率往往较低，并且常整合在受体基因组的同一位点。为了解决 以上问题，研究者又构建了含有两个T-DNA的超级双元载体，即将选择标记基因和目的基 因分别插入到同一质粒中两个相互独立的T-DNA区内。这种超级双元载体使共整合效率低 的问题得到了缓解。但是，双T-DNA转化受体细胞，得到的共整合转化细胞大部分为整合在 受体基因组的同一位点，这种情况的整合在后代遗传分离中不能分离得到无选择标记的目 的基因转化植株，如何用最简便的方法剔除这种整合是提高共转化效率的关键一步，也是 把无选择标记的转基因技术推向市场的必要途径。本发明改进了传统的双T-DNA载体，在双T-NDA区域之间加入一个启动子和特定 基因，命名为双T-DNA+1载体，这样当双T-DNA共同整合到染色体的同一位置时，该特定基 因就会在启动子的启动下表达，可以利用该特定基因的特性通过简便的方法直接剔除这种 转基因植株，选择目的基因和选择标记基因共整合到不同染色体或同一染色体不同位置的 植株进行培育，通过后代遗传分离获得无选择标记的转基因植株，这样大大节省了人力物 力财力，为了无选择标记转基因的商品化推进了重要的一步。
发明内容
本发明的一个目的是建立一种高效无选择标记的转基因载体，命名为双T-DNA+1 载体，该载体包含两个T-DNA功能结构域，分别携带选择标记基因和目的基因，在这两个 T-DNA结构域之间的区域，携带一个启动子和特定基因。该载体的标记基因可以为任何可用 于植物转化的标记基因，如潮霉素转移酶基因、卡那霉素抗性基因、膦丝霉素转移酶基因 等，目的基因包括任何有生产应用价值的基因比如抗虫基因、抗旱基、耐寒基因、抗除草剂 的基因等等。启动子包括任何植物体内源的启动子、外源启动子、组成型启动子、诱导性型 启动子、组织特异性启动子、器官诱导型启动子。特定基因包括任何致死基因和报告基因比 如红色荧光蛋白基因、绿色荧光蛋白基因、蓝色荧光蛋白基因以及GUS基因等等。本发明的另一个目的是提供一种利用该双T-DNA+1载体获得无选择标记的转基 因作物体系，具体实施过程包括1，构建携带相应目的基因的双T-DNA载体并转入农杆菌。2，利用农杆菌介导的基因转化法，把构建好的植物表达载体转化目标植物3，对获得TO代转基因苗进行分子和表型分析，剔除含有选择标记基因和特定基 因的共整合转基因后代，选择含有选择标记基因和目的基因但不含特定基因的转基因后代 进行培养。
4，种植筛选得到的Tl代转基因株系，通过PCR选择只含有目的基因的转基因植 株。进一步通过遗传分离比获得只含目的基因的转基因纯合株系。下面结合实施实例进一步阐述本发明，而不构成对本发明权利要求范围的限制。
图1植物表达双T-DNA+1载体KT350图2植物表达双T-DNA载体KT!349图IT350转基因Tl代种子表型分析，其中A为目的基因和标记基因共整合到染 色体同一位置的Tl代种子；B为目的基因和标记基因共整合到染色体不同位置的Tl代种子。实施例1 双T-DNA+1载体KT!350的构建ΚΤ350结构见附图一，为双T-DNA+AsRED基因，一个双T-DNA为选择标记基因 hptll潮霉素抗性基因，另一个双T-DNA为抗盐基因KY1，特异性基因为红色荧光蛋白基因 AsRED0以本实验室的pKAT-1为模板，扩出3k-AsRed_Tnos区域，并导入BamHI位点，通过 连接反应构建到T-easy载体上，进一步亚克隆构建到已经含有双T-DNA的载体KT349(结 构见附图二)上。构建过程中的酶切、连接、回收、纯化等分子技术，均按分子克隆手册中 的方法进行。(分子克隆实验室手册，Sambrook et al, New York Co Id Spring harbor laboratory 1989press)实施例二 KT350转化水稻苗的获得去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用0. 升汞浸泡30分 钟，进行表面灭菌(最好在摇床上进行)，无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干 水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基上，26°C暗培养。挑选色泽淡黄的愈伤组织共培养。把含有KT350载体的农杆菌AGLO在含有50mg/L Kanamycin的YM平板上划线， 黑暗培养2-3天，用一金属匙收集农杆菌菌体，将其悬浮于共培养CM液体培养基中，调
整菌体浓度至0D600为0. 3-0. 5，加入乙酰丁香酮，使其终浓度为IOOmM,即为共培养转化水 稻用的农杆菌悬浮液。挑选状态较好(继代培养5-7天、色泽淡黄)的愈伤组织放入100ml无菌三角瓶 中，加入适量农杆菌悬浮液(保证有足够的菌液与材料接触即可)，进行转化。将共培养后 的愈伤组织放在含有50mg/l潮霉素的筛选培养基上，26°C暗培养。经两轮筛选后长出的抗 性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/L潮霉素的分化培养基上 培养。当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，将小苗移到生根培养基上，培养两周左右。 选择高约10cm、根系发达的小苗，用温水洗去培养基，在温室内移栽入土。实施例三KT350转基因TO代苗的筛选以及获得实施例二得到的具有潮霉素抗性的转基因水稻苗，有三种情况，一种为选择标记 基因单转入水稻苗；第二种为选择标记基因和KYl基因共整合到染色体同一位置的转基因 水稻苗，这种情况下，AsRED也整合到染色体上，水稻的种子呈现红色见附图三，第三种为选 择标记基因和KYl基因共整合到染色体上不同位置的转基因水稻苗，这种株系是后代能够 分离得到无选择标记转基因苗的株系。一般情况下，第二种的转基因株系要占到转基因苗 的70%左右，以前的转化体系剔除这种转基因体系要到Tl代的苗期，通过PCR技术，筛选只含目标基因KYl但不含选择标记基因的株系，这样的筛选不仅工作量大，而且周期长，不利 于转基因技术的商业化。本发明中，可以利用AsRED的表达，直接剔除种子为红色的Tl代 的种子，大大减少了工作量，使转基因的高效商品化成为可能。
本发明在大豆、棉花、玉米、高粱方面的实施实例工作正在进行中。
权利要求
1.一种培育高效无选择标记转基因作物的方法，包括以下步骤a)构建目的基因和选择标记基因分别位于两个独立T-DNA结构域，在两个T-DNA结构 域间携一个启动子和特定基因的双T-DNA+1植物表达载体。b)把构建好的双T-DNA+1载体转化目的农作物，获得转化植株。c)通过特定基因的表达特性以及分子检测，筛选目的基因和选择标记基因整合在同一 植株不同染色体和同一染色体不同位置的转基因株系。d)通过遗传分离比获得无选择标记的转基因作物。
2.按照权利1要求所述，目的基因是任何的抗虫基因、抗逆基因、抗衰老基因、抗除草 剂基因、产量改良基因、品质改良基因或由上述基因组合的融合基因或多价基因。
3.按照权利1要求所述，两个T-DNA结构域之间的启动子是任何的植物内源启动子和 外源启动子，包括组成型启动子、诱导性型启动子、组织特异性启动子、器官诱导型启动子、 调节型启动子或者由调控结构域和启动子的融合片段。
4.按照权利1要求所述，两个T-DNA结构域之间的特定基因是所有的致死基因或报告 基因，这些报告基因包括红色荧光蛋白基因、蓝色荧光蛋白基因、绿色荧光蛋白基因、GUS基 因等。
5.按照权利1要求所述，其特征在于目的农作物包括所有的单子叶植物和双子叶植物。
6.根据权利5要求所述，单子叶植物为水稻、玉米、小麦、高粱、谷子、大麦、燕麦、黑麦， 双子叶植物为棉花、大豆、烟草、油菜、番茄。
全文摘要
本发明提供了一种高效获得无选择转基因农作物的方法，包括构建目的基因和选择标记基因分别位于两个独立T-DNA结构域，在两个T-DNA结构域间携一个启动子和特定基因的双T-DNA+1植物表达载体；把构建好的双T-DNA+1载体转化目的农作物，获得转化植株；通过特定基因的表达特性以及分子检测，筛选目的基因和选择标记基因整合在同一植株不同染色体或同一染色体不同位置的转化株系；通过遗传分离比获得无选择标记的转基因作物。
文档编号C12Q1/68GK102102108SQ20101056733
公开日2011年6月22日 申请日期2010年12月1日 优先权日2009年12月1日
发明者刘军华, 夏勉, 孔祥凤 申请人:北京未名凯拓作物设计中心有限公司