重组卤醇脱卤酶、编码基因、载体、工程菌及其应用
【专利说明】重组面醇脱面酶、编码基因、载体、工程菌及其应用 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种重组面醇脱面酶、编码基因、载体，重组基因工程菌，W及该重组 面醇脱面酶制备阿托伐他汀关键手性中间体巧)-4-氯基-3-哲基了酸己醋应用。 (二）【背景技术】
[0002] 面醇脱面酶，也叫面醇-面化氨裂解酶，通过分子内亲核取代机制催化芳香族或 者脂肪族邻面醇转化为环氧化物和面化氨。面醇脱面酶不但可W催化碳-面键的断裂进 行脱面反应，也可W高选择性地催化接受除了面离子W外的一系列非自然亲核试剂，如 N(V、CN^等所介导的环氧化物开环反应。面醇脱面酶主要通过蛋白结构中保守的丝氨酸与 底物哲基氧原子之间形成氨键，稳定与底物结合，通过精氨酸降低酪氨酸的地a值，酪氨酸 从底物上的氧原子作为亲核试剂，进攻邻位面素取代的碳原子，进而释放面离子，形成环氧 化物。面醇脱面酶介导的生物催化反应，优势主要体现在；1.酶催化反应条件温和；2.酶催 化手性选择高。3.酶催化转化率高
[0003] 佩-4-氯基-3-哲基了酸己醋（HN)是合成降血脂药物阿托伐他汀 (Atorvastatin)的关键中间体。根据文献报道，其合成方法可分为化学法和生物酶法两大 类。化学法合成主要包括W下途径；W(S)-环氧氯丙烷为原料，经氯化钢开环、己醇醇解、 =甲娃烷基保护、氯化钢氯化、脱保护等步骤，得到（R)-HN总收率约57%。另外，有研究人 员Wk苹果酸为起始原料，经醋化、还原、漠代和氯化四步反应得到（时-HN，合成总收率为 56.7%。由此可见，化学法不仅反应过程较繁琐，而且反应总收率较低。较之化学合成法， 生物酶法合成HN则具有反应步骤短，条件相对温和等优点。目前，可用于催化合成HN的生 物催化剂包括：面醇脱面酶、膳水解酶、脂肪酶等。其中，膳水解酶途径的底物3-哲基戊二 膳合成较为困难，而且在水解之后还需进一步醋化；脂肪酶途径中第二步反应所用催化剂 1-(3-二甲基氨基丙基）-3-己基碳二亚胺价格也非常昂贵，因此，该两条途径并不适合于 大规模生产。面醇脱面酶途径的底物（S)-4-氯-3-哲基了酸己醋（(S)-CHB巧可W由廉价 的4-氯己酷己酸己醋（C0邸）经幾基还原制得，而且脱面过程和加氯基的过程是一起完成， 并不需要额外的操作（图1)，因此，它具有较好的工业化生产潜质。
[0004] 近年来，已从多种微生物中发现了面醇脱面酶，部分面醇脱面酶的基因已被克 隆并在大肠杆菌中表达，获得产酶活力较高的基因工程菌。目前文献报道中，仅有来源 于AgrobacteriumradiobacterADI的HheC和ParvibaculumavamentivoransDS-1 的 HHDH斗L适于催化（S)-4-氯-3-哲基了酸己醋合成（R)-4-氯基-3-哲基了酸己醋。野生 型的化eC催化效率较低，而且热稳定性及对底物的耐受能力较差，Codexis公司利用蛋白 质序列-活性相关性（ProSAR)驱动的蛋白质定向进化策略对化eC进行了改造，经过18 轮的突变，得到了一株活力非常高的突变株，其催化（S)-CHBE的活力是野生型酶的约4000 倍。最优突变体在催化（S)-4-氯-3-哲基了酸己醋合成（时-4-氯基-3-哲基了酸己醋反 应过程中，底物浓度为140g/l，酶冻干粉用量为1.2g/l，反应化，产率为92%，e.e.值大于 99. 5 %。而野生型的HHDH-PL活力较高，底物浓度为200g/l，重组工程菌的用量为40g/L 时（干重），反应1化，（R)-4-氯基-3-哲基了酸己醋的产率为85%，e.e.值大于99。随着DNA测序技术的进步，急剧增加的生物信息为新酶的开发带来了前所未有的机遇，近年来基 因数据挖掘技术已成为快速开发新酶的有力手段。利用已获得的面醇脱面酶序列作为探 针，在整个基因数据库中挖掘同源序列，从而获得新型且对（S)-4-氯-3-哲基了酸己醋催 化活性更高的面醇脱面酶。 (H)
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种面醇脱面酶及其编码基因，含有该基因的重组表达载体和重组工 程菌。本发明同时还提供了一种对（S)-4-氯-3-哲基了酸己醋具有高活力的重组脱面酶， W及利用该重组面醇脱面酶或重组工程菌在高底物浓度下制备（时-4-氯基-3-哲基了酸 己醋的方法。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供一种来源于Idiomarinasalinarum的重组面醇脱面酶，所述重组面醇 脱面酶的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。
[000引本发明还提供一种所述重组面醇脱面酶的编码基因，所述编码基因的核巧酸序列 为SEQIDNo. 1 所示。
[0009] 本发明的面醇脱面酶基因来源于Idiomarinasalinarum。具体制备方法可 为：W文献报道的面醇脱面酶化heB)作为探针，在NCBI数据库捜索同源氨基酸序列， 发现该序列与Genbank中收录的预测为Idiomarinasalinarum的短链脱氨酶（Genbank No.KFZ32061. 1)的同源性为45 %，通过序列比对发现该短链脱氨酶具有与面醇脱面酶相 同的催化S联体和一些关键的保守序列，推测该水解蛋白为疑似面醇脱面酶。因NCBI公 布该短链脱氨酶的基因序列，W及在大肠杆菌异源表达的密码子偏好性，设计合成基因，交 送上海旭冠生物科技发展有限公司合成。碱基序列如SEQIDNo. 1所示的基因，命名为 HHDHw全长684bp。其中，其编码序列从第1个碱基至第684个碱基止，起始密码子为ATG， 终止密码子为TAA。其编码的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo. 2所示。
[0010] 本发明设及一种所述编码基因构建的重组载体。其可通过本领域常规方法将本发 明的重组面醇脱面酶基因连接于各种表达载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的 各种载体，如市售的质粒、粘粒、瞻菌体或病毒载体等，优选质粒为祀T28a化）。较佳的，可通 过下述方法制得本发明的重组表达载体；设计合成基因并在两端引入甜aI和化0I酶切 位点，交由上海旭冠生物技术有限公司合成，之后将合成基因与表达载体祀T28b用限制性 内切酶甜aI和化0I双酶切，形成互补的粘性末端，再经T4DNA连接酶连接，形成含有本 发明的面醇脱面酶基因的重组表达载体祀T28b-HHDHsg。
[0011] 本发明设及一种所述重组载体构建的重组基因工程菌。其可通过将本发明的重组 表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生 物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的本发明的重组面醇脱面酶基 因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希菌巧.coli)化21 0E3)。将前 述重组表达质粒祀T28b-HHDHb转化至化coli)BL2UDE3)中，即可得本发明优选的基因工 程菌株，即E.coli化21 0E3)/祀T28b-HHDHb。
[0012] 本发明还设及重组面醇脱面酶的制备方法，其中包括如下步骤：将所述重组载体 转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组面醇 脱面酶的菌体细胞。其中，所述的培养重组大肠杆菌所用的培养基可为本领域任何可使重 组工程菌生长并产生本发明的面醇脱面酶的培养基，优选LB培养基；蛋白腺lOg/l，酵母膏 5g/l，化C1lOg/l，溶剂为去离子水，pH7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可W根 据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使重组工程 菌能够生长并产生本发明所述的面醇脱面酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域 常规操作进行，优选下述方法；将本发明设及的重组大肠杆菌接种至含有终浓度50mg/L卡 那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度ODe。。达到0.8时，在终浓度为0.2mM的异丙 基-0-D-硫代化喃半乳糖巧（IPTG)的诱导下，高效表达本发明的重组面醇脱面酶。
[0013] 本发明还设及一种所述重组面醇脱面酶在催化面代醇制备（时-4-氯基-3-哲基 了酸己醋的应用，所述的应用为；W含重组面醇脱面酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿 菌体为催化剂，W(S) -4-氯-3-哲基了酸己醋为底物，WpH值为7. 5-7.8的缓冲液为反应 介质，流加化CN维持抑值为7. 5-7.8(优选先将催化剂加入反应介质中，再加入底物，湿菌 体加入时的抑值维持在8. 5，底物加入后的抑值维持在7. 8)，于10-50°C(优选20-40°C， 最优选40°C)、15化/min条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得（时-4-氯 基-3-哲基了酸己醋；所述湿菌体的用量为10~70g/L缓冲液（优选10-60g/L)，所述底 物的初始浓度为10~400g/L缓冲液（优选50-300g/L)。
[0014] 进一步，本发明所述催化剂（即湿菌体）按如下方法制备：将含重组面醇脱面酶基 因的工程菌接种至含终浓度50mg/L硫酸卡那霉素的LB培养基中，37 °C振荡培养过夜，按体 积浓度1 %的接种量接入LB液体培养基中，置37°C、180巧m摇床振荡培养，当培养液的0D e。。达到0.6时，加入终浓度为0. 5mM的IPTG作为诱导剂，28°C诱导lOh，将培养液离屯、，收 集湿菌体。