羰基还原酶基因、编码酶、载体、菌株及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从圆红冬孢酵母ZJB2014212中提取的羰基还原酶基因、编码酶、 载体、菌株及应用。 (二）
【背景技术】
[0002]立体选择性幾基还原酶（Specific Carbonyl Reductase, SCR ; Ketoreductase, KRED，EC1. 1. 1.x)是一类能够催化醇和醛/酮之间双向可逆氧化还原反 应的酶类，并且需要辅酶NAD (H)(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）或NADP (H)(烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸磷酸）作为氢传递体。NADH和NADPH作为电子供体参与其还原反应，NAD和NADP 则作为电子受体参与其氧化反应。目前立体选择性羰基还原酶主要分布于三个超家族： 短链脱氢酶/还原酶（Short-Chain Dehydrogenase/Reductases, SDRs)，中链脱氢酶/ 还原酶（Medium-Chain Dehydrogenases/Reductases, MDRs)和酸酮还原酶（Aldo-Keto Reductases, AKRs)。虽然三者的催化功能相似，但在结构上差异较大。该类酶广泛分布于各 类动物、微生物和植物中。其中，由于微生物种类繁多、分布广，是立体选择性羰基还原酶的 主要来源。目前已从多种微生物中发现了立体选择性羰基还原酶，如：Pichia finlandica、 Vibrio vulnificus、Clostridium ljungdahlii、Candida glabrata、Polygonum minus、 Serratia quinivorans、0enococcus oeni、Arabidopsis thaliana、Serratia marcescens、 Rhodococcus erythropolis、Chryseobacterium sp. 、Candida magnoliae、Lactobacillus coryniformisNLactobacillus jensenii以及Burkholderia gladioli等。此外，还从极端 微生物中发现了嗜极端环境的立体选择性羰基还原酶，如：Thermococcus guaymasensis、 Thermococcus sibiricus、Haloferax volcanii、Sulfolobus acidocaldarius、 Thermus thermophilus、Carboxydothermus hydrogenoformans、Thermotoga maritime、 Thermococcus kodakarensis、Pyrobaculum calidifontis、Koliella Antarctica和 Halobacterium sp.等。
[0003]近年来，随着基因组学、蛋白质组学和生物信息学的迅速发展，基因挖掘技术已成 为获得立体选择性羰基还原酶的重要手段。目前利用此技术已挖掘到许多的立体选择性羰 基还原酶。其中部分立体选择性羰基还原酶基因已成功在不同的宿主（大肠杆菌、毕赤酵 母等）中表达，获得选择性及产酶活力均较高的基因工程菌，并应用于羰基类化合物不对 称催化合成中。尽管如此，许多立体选择性羰基还原酶的底物识别专一性强，大大限制了其 应用范围。此外，许多酶的催化效率较低，也限制了其工业化应用。因此，筛选具有高效高 选择性的新型微生物菌株，并通过基因工程技术获得具有较宽底物谱的立体选择性羰基还 原酶，研究其在手性药物中间体合成中的应用具有重要的意义，也为实现工业化生产奠定 基础。
[0004]度洛西汀（欣百达，Cymbalta)是一种5-羟色胺及去甲肾上腺素再摄取双重抑 制剂（SNRIs)，由美国Eli Lilly公司开发。它含有噻吩结构以及一个手性中心，仅S构型 的对映体具有药物活性。噻吩酮类化合物是合成（S)-度洛西汀的关键手性中间体，其中 包括⑶-N，N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基）丙酰胺、⑶-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻 吩基）丙酰胺、（R)-3_氯-1_(2-噻吩基）-1_丙醇、（S)-3-羟基-3-(2-噻吩基）丙酸 乙酯以及（S) -3_羟基_3_(2_噻吩基）丙臆等。目前获得该类中间体的主要方法是利 用手性过渡金属配合物作为催化剂不对称还原相应的潜手性生成手性醇。微生物法不 对称还原合成噻吩酮类化合物的报道较少。Pankaj等报道了热带假丝酵母（Candida tropicalis MTCC-5158)和维斯假丝酵母菌（Candida viswanathii)催化底物 N，N_ 双甲 基-3-酮-3-(2-噻吩基）丙酰胺合成（S)-N，N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基）丙酰胺，转 化率>80%，66>99%，但底物浓度只有51111，催化时间长（24-6011)。国内专利0附02925368， CN 103013898和CN103421854公开了球饱白僵菌（Beauver iabassiana)及马克斯克鲁维 酵母（Kluyveromyce marxianus)中的羰基还原酶不对称还原制备（S)-N，N_双甲基-3-轻 基-3-(2-噻吩基）丙酰胺，底物浓度可达30g/L，转化率>80%，ee>99%。美国专利 US20130177962公开了利用酮还原酶（KRED)生产（S)-N，N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩 基）丙酰胺的方法，底物浓度可达l〇〇g/L，但该工艺需要严格的控温和反应控制，并添加异 丙醇，副产物丙酮难以去除。
[0005] 6-氯-(3R，5S)-二羟基己酸叔丁酯是HMG-CoA酶抑制剂的关键手性中间体。其化 学法合成中则需要使用易燃易爆的正丁基锂、硼烷，并且需要在<_65°C低温条件下进行，能 耗大，再加6-氯_(3R，5S)-二羟基己酸叔丁酯非对映诱导不充分，产物的光学纯度难以达 到要求。近年来，利用酶法代替化学法改善反应条件，降低反应成本，提高产物的选择性成 为关注的重点。利用酯酶拆分外消旋6-氯-(3, 5S)-二羟基己酸叔丁酯最高产率仅50%。 目前报道的能高立体选择性催化（S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原生 成 6_ 氯-(3R, 5S)-二羟基己酸叔丁酯的菌株有 Lactobacillus kefir 和 Saccharomyces 06『6￥丨81&6〇6]\0^1^0.2233 等，但催化效率较低。〇11等人将3&(^11&1'01115^68 06代￥181&6 CGMCCNo. 2233做成固定化细胞，在底物浓度低于50g/L时，底物能完全转化，并且非对映 选择性de>99%。
[0006]依泽替米贝（Ezetimibe，Ezetrol?)，化学名 1-(4-氟苯基）-(3R)-[3-(4-氟苯 基）-(3S)-羟基丙基]-(4S) - (4-羟基苯基）-2-丙内酰胺，是一类新型的选择性胆固醇吸 收抑制剂，由Merk公司研制，2002年首先在德国上市。该药物能与肠道中的胆固醇吸收 转运载体NPC1L1结合，从而有效降低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C)的含量，选择性抑制食物 以及胆汁中的胆固醇在小肠的吸收。化合物（4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基）-5_羟基戊酰 基]-4-苯基-1，3-氧氮杂环戊烷-2-酮是合成依泽替米贝的关键手性中间体，目前主要 是利用不对称还原法合成。Homann等首先发现了菌株Schizosaccharomyces octosporus ATCC 2479 和 Burkholderia cenoc epacia MTCC 5427 能催化（4S)-3-[5-(4-氟苯 基）-1，5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮生成（4S) -3- [ (5S) -5- (4-氟苯基）-5-羟基 戊酰基]-4_苯基-1,3-氧氮杂环戊烧-2-酮，de>99%。目前，Codexis公司利用蛋白质 工程技术将L. kefir中的羰基还原酶进行了多轮改造，将每轮的有益突变结合起来最终得 到一个比较理想的羰基还原酶突变体，其活性和选择性与野生型相比均得到了大幅度的提 高，成功地将该反应体系放大，在底物浓度为l〇〇g/L时，产率接近99%，de>99%。
[0007] 孟鲁斯特，化学名[3-[(lS)-[3(E)-[2-(7-氯喹啉）乙烯基]苯基-3-(乙酰苯 基）_丙基硫甲基]_2(S)_甲基环丙烷乙酸钠]，能有效地抑制半胱氨酰白三烯（LTC，LTD， LTE)与CysLT受体结合所产生的生理效应而无任何受体激动活性。利用立体选择性还原 [(E) ] _2_[3_[3_[2_ (7_氣_2_卩奎琳基）乙烯基]苯基]_3_幾基丙基]苯甲酸甲酯生成 [S_ (E) ] _2_[3_[3_[2_ (7_氣_2_卩奎琳基）乙烯基]苯基]_3_羟基丙基]苯甲酸甲酯是 合成孟鲁斯特的关键一步。由于化学法存在一定的局限性，近年来利用酶法的方法逐渐增 多。Roberge等人报道的利用Microbacterium sp. MB 5614中的酮还原酶催化该反应，ee 达95%。Codexis公司将L. kefir中的羰基还原酶进行多轮定向进化，得到了一系列突变 体，产率提高了 2000倍，并建立了异丙醇为辅助底物的辅酶循环系统，催化100g/L的底物， 产率 99. 3%，ee 99. 9%。 (三）
【发明内容】
[0008] 本发明目的是提供一种从圆红冬孢酵母ZJB2014212中提取的羰基还原酶基因、 含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及其在制备手性药物 中间体中的应用。
[0009] 本发明采用的技术方案是：
[0010] 本发明提供一种来源于圆红冬抱酵母（Rhodosporidium toruloides)ZJB2014212 的立体选择性羰基还原酶基因，所述羰基还原酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO :1所示。
[0011] 所述立体选择性羰基还原酶基因由如下方法得到：
[0012] 利用 PCR 技术，在引物 l(ATGTCTTCGCCTACTCCCAACGTC)、引物 2 (CTACCATGGCAAGAACGTCCCGTC)的作用下以来源于圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides)ZJB2014212菌株中的cDNA为模板克隆长约0. 8kb的羰基还原酶基因序列，命 名为rtscr9。将该片段连接到pGEM-T载体上，获得克隆载体pGEM-T-rtscr9,将载体转化 大肠杆菌获得含载体pGEM-T-rt SCr9的重组大肠杆菌。对重组质粒测序，并利用软件对测 序结果进行分析，该序列含有一个长759bp的开放阅读框。
[0013] 本发明表达引物 3 (catatgTCTTCGCCTACTCCCAACGTC)和引物 4 (aagcttCTACCATGGC AAGAACGTCCCGTC)，酶切位点分别为Nde I和Hindlll (下划线），以克隆载体pGEM-T-rtscr9 为模板，通过PCR扩增得到了用于表达的羰基还原酶基因。
[0014] 本发明所述圆红冬抱酵母（Rhodosporidium toruloides)ZJB2014212,保藏于中 国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC No :M 2014613,保藏日 期2014年12月2日，邮编430072。
[0015] 任何对SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、插入或缺失 处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸具有90%以上的同源性，均属于本发明的保护 范围。
[0016] 本发明提供一种由所述羰基还原酶基因（rtscr9)编码的重组羰基还原酶，命名 为RtSCR9,所述重组羰基还原酶的氨基酸序列为SEQ ID N0:2所示。
[0017] 任何对SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中氨基酸进行插入、缺失或替换的处理获得 的多肽片段或其突变体，只要其与SEQ ID N0:2所示氨基酸序列具有95%以上同源性，均属 于本发明的保护范围。
[0018] 本发明涉及含所述羰基还原酶基因的重组载体。
[0019] 本发明涉及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌，具体为：将羰基 还原酶基因同表达载体pET28a连接，构建了含有羰基还原酶基因的异源表达重组质粒 pET28a_rtscr9。将表达重组质粒pET28a_rtscr9转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中， 获得含有重组质粒pET28a-rtscr9的重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET28a-rtscr9。
[0020] 本发明还涉及羰基还原酶基因在构建重组羰基还原酶中的应用，具体为：构建 含有所述羰基还原酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌（优选E.coli BL21 (DE3))中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组羰基还原 酶的菌体细胞，破碎后获得的羰基还原酶粗酶液进行纯化，获得羰基还原酶纯酶。
[0021] 本发明还涉及所述羰基还原酶在制备手性药物中间体中的应用，所述应用为： 以含羰基还原酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，于pH值为6~ 10的