一种苹果酸脱氢酶基因rkmdh2及其重组表达载体的制作方法
【技术领域】
[0001]以红冬抱酵母kratochvilovae)YM25235 的总 RNA 反转录产物cDNA为模板，扩增得到编码苹果酸脱氢酶(MDH)的基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体后诱导表达，亲和层析法纯化后得到纯酶，并对该酶进行了酶活测定及酶学性质的相关研究，属于基因工程和酶工程领域。
【背景技术】
[0002]苹果酸脱氢酶(MDH)广泛分布于生物体内，是一种活性非常强的酶，它催化草酰乙酸盐和苹果酸盐的相互转化反应，与二核苷酸辅酶的氧化还原相关。草酰乙酸盐在许多代谢途径中都有重要作用，包括三羧酸循环、乙醛酸旁路、氨基酸合成、糖原异生等，并维持氧化还原平衡，还能促进胞质和亚细胞器代谢物的交换。依生物体的功能不同、组织差异、细胞内定位的不同其表达种类不同，MDH具有多种同工酶形式。胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)存在于细胞胞质内，担负着将NADH转入线粒体的重任，并且还对调控三羧酸循环有作用，同时cMDH还是核酸通路(NACh)复合体的一个组成部分
苹果酸脱氢酶(MDH)广泛分布在动物组织、微生物和植物中。它是一种活性最强的酶，根据亚细胞定位，苹果酸脱氢酶可分为5种类型，存在于乙醛酸体、线粒体、过氧化物体、叶绿体、细胞浆以及锥虫甘油体内。MDH为多聚体酶，是由相同或相似亚基组成的二聚体或四聚体，亚基的分子量为30-35kDa，MDH在医学方面也引起越来越多的关注如利用基因工程疫苗预防人体带绦虫病已是备受关注的研究方向，通过牛带绦虫亚洲亚种MDH基因的生物信息学分析，预测到胞浆型MDH是一个潜在的诊断抗原，这为带绦虫在诊断、药物及疫苗研究中的应用前景提供了重要的线索，在临床诊断中用于多酶分析及疾病的早期诊断，例如用于诊断DIC (弥散性血管内凝血)，心肌梗塞，急慢性肝炎等。在食品领域，苹果酸脱氢酶用于有机酸含量的测定，如L-苹杲酸、醋酸、柠檬酸等物质的测定，应用前景广泛。利用MDH底物专一性，还可将其用于拆分D，L-苹果酸酶。
[0003]总之，MDHs作为生物体中枢代谢途径的关键酶，国内外对其己进行了较为广泛的研究，MDHs同工酶正应用于生物分类、物种分化、遗传变异、物种杂交和个体发育等研究。因此深入了解MDHs的生理生化特性、结构及功能、催化机制，对于酶重组蛋白的表达、纯化及免疫特性分析，探讨生物体中MDHs的代谢作用以及一些疾病的分子致病机制有着重要的意义。同时MDH的应用研究也将会推动MDHs转基因植物及手性药物的进一步发展。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种从红冬抱酵母(Rhodosporidium kra tochvilovae)YM25235中分离的苹果酸脱氢酶基因欣置扮么该基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或该核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1008bp(碱基)，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽或其片段。
[0005]本发明的另一目的是提供一种含有苹果酸脱氢酶基因欣置%2的重组表达载体pET32aRKMDH2，该重组表达载体是将SEQ ID NO: 1所示基因直接与载体pET32a ( + )所构建的重组表达载体。
[0006]本发明另一目的是提供一种含有上述的苹果酸脱氢酶基因欣或上述的重组表达载体的宿主表达细胞。
[0007]用本发明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重组载体优化宿主细胞可用本领域的技术人员熟知的方法进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期收集菌体，用CaCl2、电穿孔等方法进行；当宿主是真核生物，可选用DNA转染法、显微注射、电穿孔、脂质体包装等方法。
[0008]本发明提供的核苷酸序列是一种高效、特异性的苹果酸脱氢酶基因，可以将其与载体连接后转化至微生物细胞体内生产苹果酸脱氢酶，具有产物特异性高、生产周期短、生产不受场地、气候、季节的影响及利用不同的菌种和培养基适合开发商业化苹果酸脱氢酶等优点。本发明应用基因工程技术构建特异性生产苹果酸脱氢酶的转基因大肠杆菌生产苹果酸脱氢酶，具有操作简单、成本低、可行性高等优点，为苹果酸脱氢酶基因工程化生产奠定基础。
【附图说明】
[0009]图1为利用本发明的红冬孢酵母YM25235苹果酸脱氢酶基因构建的大肠杆菌重组表达质粒pET32aRKMDH2质粒图谱；
图2为本发明的苹果酸脱氢酶基因锈导表达并纯化后的SDS-PAGE分析图，其中:1为蛋白电泳Marker ;2为转化了 pET32a(+)并经IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；3为转化了 pET32aRKMDH2并经IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；4为纯化的目的蛋白条带。
【具体实施方式】
[0010]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
[0011]实施例1:红冬孢酵母苹果酸脱氢酶基因RKMD_H
米用 OMEGA 试剂盒 E.Z.N.A Fungal RNA Kit 从红冬抱酵母{Rhodosporidiimkra toch vilo vae) YM25235 中提取总 RNA，用反转录试剂盒 Thermo Scientific Maxima HMinus First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，取1 μ 1为模板进行聚合酶链式反应，设计引物(引物1和引物2)进行PCR扩增，反应所用引物、组分和扩增条件如下:
引物 P1:RKMDH2F1: 5，-ATGGGCCTCAAGACTGCTGTTCT-3’ (SEQ ID NO:3)
引物 P2:RKMDH2R1: 5，-TCAGAGCTTGGAGCCCTGGATGA-3’ (SEQ ID N0:4)
PCR扩增体系(50 μ L)组成如下:
5 X Trans PFU Buffer10 μ L
dNTP (2.5 ymol/L)5 yL
cDNA1 μL
RKMDH2F1 (10 ymol/L)2 yL
RKMDH2R1 (10 ymol/L)2 yL Fast Pfu DNA polymerase (5U/μ L)2 μ L
无菌ddH20补足至50 μ L
扩增条件:94°C变性4min，再用94°C 45s、59°C 45s、72°C 1.5 min进行30个循环，最后72°C lOmin，反应完后取产物1 μ L，然后在浓度为1%的琼脂糖凝胶中，进行电泳分析。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，用百泰克生物技术有限公司多动能DNA纯化回收试剂盒回收目的片段，然后将PCR扩增得到的目的基因连接到pMD18-T上，连接产物转化大肠杆菌DH5a，用含有氨苄青霉素(Amp+)的LB固体平板进行筛选，挑取平板上的转化子进行菌落PCR筛选阳性克隆，然后送去上海生工测序。测序结果显示，获得一段1008bp长的序列，命名为欣么序列组成如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。通过核苷酸序列所编码的氨基酸相似性搜索表明，该基因编码的蛋白与真菌来源的苹果酸脱氢酶序列相似，但不完全相同。
[0012]实施例2:重组表达质粒pET32aRKMDH2的构建
采用实施例1中的cDNA为模板进行PCR扩增，反应所用引物组合、反应组分和扩增条件如下:
引物 P1:RKMDH2F2: 5’ -CGCGGATCCATGGGCCTCAAGAC