Cd28基因过表达载体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种⑶28基因过 表达载体及其应用。
【背景技术】
[0002] 哺乳动物及其它脊椎动物在应对外界各种病原微生物侵袭及排除异物维持自身 平衡的过程中，逐渐形成了强有力的免疫保护屏障。包括体液免疫和细胞免疫。T细胞是 大多数免疫反应的核心。识别特异性抗原后，T细胞被活化、增殖、分化，从而具有效应功能 或辅助作用。初始(Nafv'e)T细胞的活化需要来自抗原递呈细胞的两种刺激信号。第一种 是TCR/Q33与抗原递呈细胞（Antigenpresentingcells,APCs)表面特异的MHC-抗原肽 复合物结合产生的特异性的抗原刺激信号；第二种是由T细胞表面的共刺激受体分子和抗 原递呈细胞（APCs)表面相应的配体结合产生的非特异性的刺激信号。如果缺失第二种信 号，TCR与抗原肽的识别通常导致T细胞的凋亡或无能状态（Anergy)。
[0003] ⑶28/B7是免疫球蛋白受体超家族（IgSF)中发现最早、最为重要的一种信号通 路。⑶28存在于初始：(Maive)⑶4+和⑶8+T细胞表面，与APCs表面的B7-1、B7-2配体结 合，增加E-2的产生，为T细胞的生长、存活提供了重要的共刺激信号，从而阻止细胞进入 无能状态（Anergy)或死亡。研究表明，⑶28/B7共刺激信号通过募集脂筏增强T细胞与 APCs细胞相互作用从而起到减少T细胞分泌细胞因子和增殖所需TCR量的作用，也就是说 可以降低T细胞激活所需第一信号的阈值。
[0004]总体来说，以CD28为代表的免疫球蛋白超家族受体介导的共刺激信号，不仅能够 增强TCR介导的信号，而且对T细胞早期的激活与增殖发挥重要作用。其主要效应包括：激 活NF-kB、NFAT、AP1等转录因子，上调BCL-XL等抗凋亡因子，促进T细胞的活化与存活；上 调表达IL-2、IL-4、IFN-y等细胞因子的表达，促进T细胞的增殖与效应；上调表达IC0S、 0X-40、4_1BB等其他共刺激受体，为T细胞后期的增殖、存活与记忆性T细胞的形成以及二 次应答做准备等。
[0005] 此外，基于小鼠和猪模型发现，CD28在体外、体内均能够刺激T细胞的激活、增殖 和效应功能，是潜在的广谱抗病基因。
[0006] 我国作为养猪大国，猪病疫情严重制约了养猪企业的扩张与发展。在我国，猪场常 发的传染性疾病，如蓝耳病、猪圆环病毒II型感染、猪流感、猪瘟、猪气喘病、猪大肠杆菌病 和猪附红细胞体病等，给养猪业造成极大的危害。然而，我国猪用疫苗的应用尚存在许多问 题，如副反应较大，免疫效果不理想等。而CD28的生物学功能，提示可以通过转基因的手段 增强猪群的抗病能力。
[0007] CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/ Cas (CRISPR-associated)系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质的免疫系统，通 过序列特异的RNA介导，切割降解外源性DNA，包括噬菌体和外源质粒。CRISPR/Cas系统 可以作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点是操作简单、成本低、作用高 效。2013年，科学家首次报道CRISPR/Cas系统在真核细胞上应用成功，随后，在斑马鱼、果 蝇、小鼠、大鼠、猪中迅速得到应用。CRISPR/Cas系统在靶位点产生双链DNA断裂（double strandbreak,DSB)，细胞可通过非同源末端连接（non-homologousendjoining,NHEJ)进 行修复，导致基因发生移码突变，丧失功能。除此之外，该系统还能与同源重组载体、寡聚核 苷酸共同作用，使靶基因发生高效的精确修饰。2014年，ScottJG等利用CRISPR/Cas介导 的同源重组在斑马鱼上实现了基因的替换。HuiYang等利用相同的策略一步获得了带有报 告基因的小鼠。CRISPR/Cas系统凭借其巨大优势迅速成为基因编辑工具中的佼佼者，在基 因功能研究、疾病模型、基因治疗等领域得到广泛的应用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种⑶28基因过表达载体及其应用，即通过基因工程手段 增加宿主CD28基因的拷贝数，从而降低T细胞活化的阈值，增强T细胞的效应功能，达到广 谱抗病效果。
[0009] 为了实现本发明目的，本发明提供的一种⑶28基因过表达载体，其是以目标生物 基因组为模板，PCR扩增R0SA26基因第一内含子的左、右同源臂，⑶28基因表达框，0CT4基 因启动子，然后将同源左臂，⑶28基因表达框，含LoxP位点的0CT4基因启动子调控的Cre 表达框和Neo基因表达框，同源右臂以及负筛选标记DTA依次连接，并构建到真核表达载体 上，即得⑶28基因过表达载体。
[0010] 本发明所述的目标生物包括但不限于猪。
[0011] 优选地，本发明中使用的真核表达载体为pd2EYFP-Nl。
[0012] 其中，PCR扩增得到的R0SA26基因第一内含子的左、右同源臂以及⑶28基因表达 框的核苷酸序列分别如SEQIDNO. 1~3所示；所述含LoxP位点的0CT4基因启动子调控 的Cre表达框的核苷酸序列如SEQIDN0. 4所示；所述Neo基因表达框的核苷酸序列如SEQ IDN0. 5所示；所述负筛选标记DTA的核苷酸序列如SEQIDN0. 6所示。
[0013] 本发明还提供所述⑶28基因过表达载体的构建方法，所述方法包括以下步骤：
[0014] (1)以pd2EYFP-Nl为载体骨架，利用酶Ndel和Kpnl插入猪R0SA26基因第一内含 子的同源左臂，同时引入EcoRv酶切位点，得到载体pd2EYFP-5'arm;
[0015] (2)利用酶EcoRV和Kpnl插入CD28基因表达框，得到载体pCD28-5' arm ;
[0016] (3)利用酶EcoRI和NotI将Neo基因表达框与Cre基因连接起来，再利用酶Ndel 和NotI将其连在0CT4基因启动子下游，组成双表达框LoxP-0CT4-Cre-3 'UTR-SV40-Ne〇-3 ' UTR-LoxP，利用酶KpnI和No11将上述双表达框连到载体pCD28-5 ^arm上，同时引入AscI 酶切位点，得到载体pCDOCN-5'arm;
[0017] (4)利用酶AscI和PacI插入猪R0SA26基因第一内含子的同源右臂；
[0018] (5)利用酶PacI和Notl插入DTA基因表达框，构建得到⑶28基因的同源重组载 体p⑶0CNDR，即为⑶28基因过表达载体。
[0019] 其中，用于PCR扩增猪R0SA26基因第一内含子的同源左臂的引物对的核苷酸序列 如SEQIDN0. 7-8所示；用于PCR扩增猪R0SA26基因第一内含子的同源右臂的引物对的核 苷酸序列如SEQIDN0. 9-10所示；用于PCR扩增⑶28基因表达框的引物对的核苷酸序列 如SEQIDN0. 11-12所示；用于PCR扩增0CT4基因启动子的引物对的核苷酸序列如SEQID NO. 13-14所示；用于PCR扩增Cre表达框的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO. 15-16所示。
[0020] 本发明还提供所述载体在制备抗病转基因猪中的应用。所述应用具体如下：
[0021] 将所述载体（pCDOCNDR)与特异性靶向猪R0SA26基因第一内含子的CRISPR/Cas9 打靶载体共同转入猪胎儿成纤维细胞中，获得定点整合CD28基因的阳性细胞克隆；以阳性 克隆为核移植供体细胞，猪卵母细胞为核移植受体细胞，通过体细胞核移植技术获得克隆 胚胎；将克隆胚胎移入猪子宫内妊娠，即获得在R0SA26基因第一个内含子定点整合有CD28 基因且自动敲除标记基因的转基因猪。
[0022] 其中，所述打靶载体中含有特异性靶向猪R0SA26基因第一内含子的sgRNA的编码 基因序列，编码所述sgRNA的DNA序列如SEQIDN0. 21和22所示，二者为互补配对的寡聚 核苷酸序列。
[0023] 所述特异性靶向猪R0SA26基因第一内含子的CRISPR/Cas9打靶载体的制备方法 如下：将SEQIDN0. 21和22所示的寡聚核苷酸，在94°C变性5min，然后在37°C退火lOmin， 最后在4°C放置5min;得到的退火产物与经Bbsl酶切过的pX330骨架连接，即得打靶载体。
[0024] 前述的应用，用于鉴定定点整合⑶28基因的阳性细胞克隆的特异性PCR引物组合 如下：
[0025]短臂引物SF:5'-CGCACCCTTACCTTGTCCCA-3'（SEQIDN0.23)，该引物位于同源臂 上游；短臂引物SR:5' -GAAGGTGGGATGGAGGGTGA-3'（SEQIDN0.24)，该引物位于CD28 启动 子上，PCR扩增产物大小为2500bp。
[0026]长臂引物LF:5' -ACCGCTTCCTCGTGCTTTAC-3'（SEQIDNO. 25)，该引物位于Neo基 因上；长臂引物LR:5' -AGCTGCCTCCTGTGATTACC-3'（SEQIDNO. 26)，该引物位于同源臂下 游，PCR扩增产物大小为8000bp。
[0027] 本发明首次利用CRISPR/Cas9技术介导⑶28基因同源重组，增加宿主⑶28基因 的拷贝数，从而降低宿主T细胞活化的阈值，增强T细胞的效应功能。该方法成本低，大幅 缩短获得纯合子猪的时间，并保证猪共刺激受体CD28的表达不受基因编辑的影响，为利用 CRISPR/Cas9技术介导⑶28同源重组进行基因功能研究及动物疾病模型建立奠定了基础。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明实施例2CRISPR/Cas9打靶载体的构建过程示意图。
[0029] 图2为本发明实施例3中CD28转基因猪胎儿成纤维细胞的筛选过程示意图。
[0030] 图3为本发明实施例3中阳性细胞单克隆PCR鉴定引物设计策略示意图。
[0031] 图4为本发明实施例3中阳性细胞单克隆短臂PCR鉴定结果。
[0032] 图5为本发明实施例3中阳性细胞单克隆长臂PCR鉴定结果。
[0033] 图4和图5中，泳道M为DNA分子量标准（D2000PlusDNALadder)，泳道P为扩 增产物，泳道N为阴性对照。
【具体实施方式】
[0034] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&