新的高效基因载体及其制备和应用的制作方法

本发明公开了一种新颖的树枝状大分子化合物的制备和应用，这种树枝状大分子是以抗癌药物结构为核心的树枝状化合物，本发明公开了其制备方法和用途。该以抗癌药物结构为核心的树枝状化合物基因载体是一种低毒高效的基因载体，可以增加胞吞作用，并且快速进入细胞质中，增加肿瘤细胞胞吞治疗基因，也可以携带基因进入细胞核的基因载体，并且具有降低肿瘤细胞耐药性，并能提高细胞的抗氧化能力。
背景技术：
：在未来的临床治疗中，个性化的基因治疗取代化学药物治疗疾病已经成为科学界的共识，目前最大的障碍如何高效地把外源的基因导入到靶细胞中，或是相应的环境中，使之能纠正或补偿基因缺陷或是异常引起的疾病，简单地说就是如何把外源基因或是遗传信息通过基因转移技术将其插入到受体细胞中。那么核心问题落到基因载体上。目前基因载体技术日益发展，主要分为病毒载体和非病毒载体。由于机体免疫问题和宿主整合风险等问题，病毒载体基本不会作为未来临床治疗的首选。非病毒载体的开发是科学家目前工作的重点领域。重点即是高转染率和低毒性。本发明公开了一种新颖的含有树枝状大分子的基因载体的制备和用途，这种基因载体是以树枝状大分子和抗癌药物组成的基因载体，本发明公开了其制备方法和用途。该基因载体是一种低毒高效的基因载体，可以增加胞吞作用，并且快速进入细胞质中，增加肿瘤细胞胞吞治疗基因，也可以携带基因进入细胞核的基因载体，并且具有降低肿瘤细胞耐药性，并能提高细胞的抗氧化能力。技术实现要素：本发明公开了下式所示的结构，是一种含有抗癌化合物结构的新的树枝状大分子，其特点为抗癌药物在树枝状大分子的核心部分，外周为对称的树枝状大分子，其结构如下：其中该新的树枝状大分子化合物中的中心结构部分为抗癌药物，所述抗癌药物为临床所用天然及非天然抗癌药物,优选蒽环类抗生素。其中结构代表以S-S为内核的，近似球状的高度枝化的m代树枝状大分子，其中m为树枝状大分子的代数，m取0-50之间的整数以及0.5的倍数。和结构均代表半个树枝状大分子。其中结构中的Linker代表一种带有三个枝岔分支的分枝状结构化合物，一个分枝与抗癌药物化学连接，另两个分枝与树枝状大分子化学连接，形成以抗癌药物为核心的外周为树枝状大分子的化合物。该分枝状化合物含有可与-SH反应的活性基团。该分枝状化合物，优选本发明的化合物的制备方法，其特征在于：1)将以S-S为核心的树枝状大分子Gm，其中m为树枝状大分子的代数，m取0-50之间的整数以及0.5的倍数，Gm在维生素C、二硫苏糖醇或是亚硫酸氢钠的催化下分解为带有SH健活性的半个树枝状大分子Gm的A；2)分枝状化合物Linker与抗癌药物偶联生成带有分支结构的化合物B；3)一倍摩尔的化合物B与两倍摩尔的化合物A在0-20度的溶剂中过夜搅拌反应，反应得到含有抗癌药物结构的树枝状化合物C；4)将制备所得的以抗癌药物结构为核心的树枝状化合物C洗涤后冻干，或是加入冻干保护剂，在真空干燥箱中冻干24-96小时，得到最终产品备用；反应所述结构如下树枝状大分子化合物Gm：化合物A:化合物B:其中该结构属于Linker结构内的结构；化合物C:其中所述化学步骤1-4选用溶剂选自：苯、甲苯、吡啶、四氢呋喃、三氟乙酸、氯仿、四氯化碳、3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、磷酸三(2-氯乙基)酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇、甲醚.乙醚,二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。抗癌药物优选蒽环类抗生素。本发明的制备方法具体如下：1)将以S-S为核心的树枝状大分子Gm(可商购)，其中m为树枝状大分子的代数，m取0-50之间的整数以及0.5的倍数，Gm在维生素C(可商购)、二硫苏糖醇(可商购)或是亚硫酸氢钠(可商购)的催化下在有机溶液中还原分解为带有SH健活性的半个树枝状大分子Gm的A；2)分枝状化合物Linker(可商购，也可制备)与抗癌药物(可商购)在PH为5-9的条件下，常温反应1-48小时反应偶联生成带有分支结构的化合物B，而后冻干备用；3)一倍摩尔的化合物B与两倍摩尔的化合物A在0-20度的溶剂中过夜低速50rpm-500rpm搅拌反应，反应得到含有抗癌药物结构的树枝状化合物C；4)将制备所得的以抗癌药物结构为核心的树枝状化合物C直接洗涤后冻干，或是加入冻干保护剂(山梨酸钾，甘露醇，羧甲基纤维素钠等)，在真空干燥箱中冻干24-96小时，得到最终产品备用；Gm还原为带有SH健活性的半个树枝状大分子Gm的AInsoluble+Linker生成B而后冻干后备用，称量重量后用于动物实验。在未来的临床治疗中，个性化的基因治疗取代化学药物治疗疾病已经成为科学界的共识，目前最大的障碍如何高效地把外源的基因导入到靶细胞中，或是相应的环境中，使之能纠正或补偿基因缺陷或是异常引起的疾病，简单地说就是如何把外源基因或是遗传信息通过基因转移技术将其插入到受体细胞中。那么核心问题落到基因载体上。目前基因载体技术日益发展，主要分为病毒载体和非病毒载体。由于机体免疫问题和宿主整合风险等问题，病毒载体基本不会作为未来临床治疗的首选。非病毒载体的开发是科学家目前工作的重点领域。重点即是高转染率和低毒性。本发明公开了一种新颖的含有树枝状大分子的基因载体的制备和用途，这种基因载体是以树枝状大分子和抗癌药物组成的基因载体，本发明公开了其制备方法和用途。该基因载体是一种低毒高效的基因载体，可以增加胞吞作用，并且快速进入细胞质中，增加肿瘤细胞胞吞治疗基因，也可以携带基因进入细胞核的基因载体，并且具有降低肿瘤细胞耐药性，并能提高细胞的抗氧化能力。附图说明：图1实施例1的终产物的核磁共振图谱图2实施例1的终产物的核磁共振图谱图3实施例1为基因载体的胞吞实验图4载体G3为基因载体的胞吞实验图5柔红霉素普通制剂组(未用基因载体)的胞吞实验具体实施方式下面具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明不仅局限以下实施例。制备实施例如下：实施例11)将以S-S为核心的树枝状大分子聚酰胺-胺G3(商购)，在亚硫酸氢钠(商购)的催化下24小时在二氯甲烷溶液中还原分解为带有SH健活性的半个树枝状大分子G3；还原为2)分枝状化合物LinkerA(可商购，也可制备)在N,N-二甲基甲酰胺和三氟乙酸催化下加入乙酸酐生成LinkerB(可商购，也可制备)，而后LinkerB与溶解度低的药物柔红霉素(商购)在PH为7的条件下，常温反应24小时反应偶联生成带有分支结构的化合物B，而后冻干备用；3)一摩尔的化合物B与两摩尔的化合物A在10度的氯仿、石油醚互混溶液中过夜低速100rpm搅拌反应，反应得到含有抗癌药物结构的树枝状化合物C；4)将制备所得的以抗癌药物结构为核心的树枝状化合物C在水溶液中洗涤后，在真空干燥箱中冻干48小时，得到最终产品备用；实施例21)将以S-S为核心的树枝状大分子聚酰胺-胺G2(商购)，在亚硫酸氢钠(商购)的催化下24小时在二氯甲烷溶液中还原分解为带有SH健活性的半个树枝状大分子G2；2)分枝状化合物LinkerA(可商购，也可制备)在N,N-二甲基甲酰胺和三氟乙酸催化下加入乙酸酐生成LinkerB(可商购，也可制备)，而后LinkerB与溶解度低的化合物多柔比星(商购)在PH为7.5的条件下，常温反应20小时反应偶联生成带有分支结构的化合物B，而后冻干备用；3)一摩尔的化合物B与两摩尔的化合物A在20度的氯仿的水溶液中过夜低速200rpm搅拌反应，反应得到含有多柔比星抗癌药物结构的树枝状化合物C；4)将制备所得的以抗癌药物结构为核心的树枝状化合物C在水溶液中洗涤后，在真空干燥箱中冻干24小时，得到最终产品备用；效果实验如下：将实施例1-2制备的冻干样品，G2，G3以及柔红霉素和多柔比星均称量相同重量，用蒸馏水溶液配置成10mg/100ml的物用药组，以蒸馏水作对照组，考察本发明化合物基因载体性能。制备H22肝癌小鼠模型，按照传统方法，将H22细胞植入小鼠腋下，制备H22核瘤小鼠模型后，分为8组，即对照组(不用药)，P27直接给药组，实施例1-2制备的样品以及G2和G3(商购)携带P27组，化药多柔比星和柔红霉素组，每组20只小鼠。将实施例1-2制备的样品以及PAMAM2代和3代树枝状高分子携带P27。(携带等量P27，每组含10ulP27)，分别瘤内注射各组小鼠体内，试验2周后，处死小鼠，取瘤用卡尺测量体积，结果如下。表瘤大小比较表1肿瘤体积(单位：cm3)组别瘤大小对照组16.65±2.65G412.65±1.84G112.76±1.64柔红霉素13.29±1.81多柔比星13.52±1.78实施例15.16±0.68实施例25.22±0.65直接注射P2713.88±1.73将实施例1-2(自身有荧光)，G2和G3的氨基偶联罗丹明，将其放入培养好的SCC15口腔癌细胞中，而后培养1小时，各种基因载体均放入等量浓度1ug/ml，DAPI染色细胞核，在共聚焦显微镜下可观察到，实施例1-2可以将进入到细胞核，而且非常迅速，在1小时内即可大量进入细胞内，而G2和G3不能进入细胞核，化疗药物组也不能进入细胞核，而且在1小时内只有少量G2，G3载体进入细胞质。见图3-图5分别为实施例1，柔红霉素组和G3组。从蓝色细胞核可以看出，实施例1,2毒性非常小，小于G2和G3.实施例1，红色代表载体G3，红色代表载体柔红霉素,红色代表柔红霉素制备口腔癌小鼠模型，分为8组，即对照组(不用药)，SURVIVIN基因直接给药组，实施例1-2制备的样品以及G2和G3(商购)携带SURVIVIN基因组，每组8只小鼠。将实施例1-2制备的样品以及PAMAM2代和3代树枝状高分子携带SURVIVIN基因。(携带等量SURVIVIN基因，每组含10ul)，分别静脉注射各组小鼠体内，试验2周后，处死小鼠，取瘤用免疫荧光手段检测，记录Ho-1和GST蛋白酶的表达量(mmol/mm2)组别HO-1对照组3.9±1.4G24.8±1.1G35.2±1.0柔红霉素4.1±1.3多柔比星5.0±1.4实施例111.6±2.3实施例210.4±2.0直接注射Survivin4.2±1.3其中，GST越高代表耐药性越强，HO-1越高，抗氧化能力越强。当前第1页1 2 3