羰基还原酶基因、酶、载体、工程菌及其在不对称还原前手性羰基化合物中的应用
【专利说明】嚴基还原酶基因、酶、载体、工程菌及其在不对称还原前手 性嚴基化合物中的应用 (-)技术领域
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种来源于唐营蒲伯克霍尔德氏菌 炬urldiolderia gladioli)ZJB-12126的撰基还原酶、基因、含有该基因的重组载体、该重组 载体转化得到的重组基因工程菌W及在催化不对称还原前手性撰基化合物制备手性醇中 的应用。 (二）【背景技术】
[0002] 撰基还原酶（Carbonyl reducatase, E. C. 1. 1. 1. X)属于氧化还原酶系，是一类能 够催化醇和酵/丽之间双向可逆氧化还原反应的酶类，并且需要辅酶NAD (H)(烟醜胺腺嘿 岭二核巧酸）或NADP(H)(烟醜胺腺嘿岭二核巧酸磯酸）作为氨传递体。NADH和NADPH 作为电子供体参与其还原反应，NA扩和NADP+则作为电子受体参与其氧化反应。目前根 据文献报道的撰基还原酶一般属于短链脱氨酶超家族（Skxrt-chain dehy化ogenase/ reductase, SDR)、中链脱氨酶超家族（Medium-chain dehy化ogenase/reductase, MDR)、 酵丽还原酶超家族（Aldo-keto reductase, AKR)等。虽然H者具有相似的催化功能， 但在进化和结构上差异较大。撰基还原酶是一类非常古老的家族，广泛分布于自然界 中，在各类动物、微生物和植物中，由于微生物种类繁多、分布广，是撰基还原酶的主要来 源，女口：Pichia finlandica、Clostridium ljungdahlii、Vibrio vulnificus、Candida glabrata、Serratia quinivorans>Polygonum minus>Arabidopsis thaliana、Oenococcus oeni、 Serratia marcescens、 Chryseobacterium sp. 、 Rhodococcus erythropolis、 Candida magnoliae、Lactobacillus jensenii 和 Lactobacillus coryniformis 等。此 夕F，极端微生物中也存在嗜极端环境的撰基还原酶，如来源于化ermococ州s sibiricus、 Thermococcus guaymasensis、Haloferax volcanii、Thermus thermophilus、Sulfolobus acidocaldarius> Carboxydothermus hydrogenoformans> Thermococcus kodakarensis> Thermotoga maritime、 Koliella Antarctica、 Pyrobaculum calidifontis 和 化lobacterium sp.等极端微生物的撰基还原酶。
[0003] 近年来，随着基因组学、蛋白质组学和生物信息学的迅速发展，基因组和基因序列 数据库中公布的基因数据的迅速增长，从大量的数据资源中寻找新型的撰基还原酶基因、 挖掘其蕴含的生物学信息，为新型高效生物催化剂的开发服务已经成为现实。基因挖掘 技术是在此基础上发展起来的一项新型酶筛选技术，目前已得到广泛地应用，通过此技术 已克隆获得了大量的撰基还原酶，如Pichia finlandica 0DH、Clostridium ljungd址lii BDHl、Candida glabrata KRl、Serratia quinivorans SDR、Polygonum minus ADH、 Arabidopsis thaliana ADH、Oenococcus oeni Adh3、Chryseobacterium sp. KRED20、 Candida ma即oliae CRW及Acetobacter sp. CR等。其中部分撰基还原酶的基因已在不同 的宿主，女口 Escherichia coli、Pichia pastoris、Arxula adeninivorans 等中表达，获得 产酶活力和选择性较高的基因工程菌，并成功应用于催化前手性撰基类化合物的不对称还 原反应。尽管如此，许多撰基还原酶催化的底物谱较窄，往往是为特定反应筛选的最适生物 催化剂，因此大大限制了其应用范围。此外，许多酶的催化效率较低，也限制了其工业化应 用。筛选具有较宽底物谱的新型撰基还原酶，研究其可W高效高选择性催化的撰基化合物， 不仅可W拓宽其应用范围，提升其应用潜力，也为实现工业化生产奠定基础。
[0004] 手性醇是一类手性碳上连有羟基的旋光性化合物，广泛应用于手性药物和其他手 性精细化学品的合成。目前手性醇的合成方法包括物理分离法、拆分法W及不对称还原法。 其中，利用前手性撰基化合物的不对称还原合成手性醇的方法是目前生产手性醇的一种重 要方法，其理论产率达100 %。化学不对称还原法主要是利用手性金属配合物作为催化剂用 于撰基的不对称还原，尽管该化学方法已部分用于工业生产，但是该反应过程需要高压加 氨、手性金属配合物合成复杂并且价格昂贵，产物中存在重金属的残留导致产物分离困难， 环境污染较大，因此其应用受到了一定的限制。生物催化不对称还原法不仅具有高度的化 学、区域和立体选择性，并且反应条件温和，避免了产物中的重金属残留，对环境友好，弥补 了化学方法的不足，因此，近年来生物催化的撰基不对称还原反应在手性醇合成中的应用 越来越受到重视。
[0005] (2S，3时-2-苯甲醜氨甲基-3-羟基下酸醋是合成碳青霉帰和青霉帰类药物中 间体4-己醜氧基氮杂环下丽（4-AA)的手性硕块。目前获得（2S，3R)-2-苯甲醜氨甲 基-3-羟基下酸醋中间体的主要途径是W手性催化剂（时-BINAP-Ru或错配合物不对称催 化2-苯甲醜氨甲基-3-丽下酸醋生成（2S，3R)-2-苯甲醜氨甲基-3-羟基下酸醋。但由于 该反应条件苛刻、金属钉配合物的价格比较昂贵并且与产物的分离较为困难等，不利于其 工业化应用。目前生物催化法合成（2S，3R)-2-苯甲醜氨甲基-3-羟基下酸醋报道较少。 Saccharomycopsis malanga NBRC 171096催化生成（2S, 3R)构型，并具有较商的对映选择 性（对映体过量值ee〉96. 2%)，但是催化效率低（产率仅4%)。美国专利US20130034895 研究了来源于Lactobacillus kefir的撰基还原酶催化合成（2S, 3R)-2-苯甲醜氨甲 基-3-羟基下酸醋，具有较高的对映选择性（ee为60-99% )，但在该反应过程中，W异丙醇 作为第二底物实现辅酶循环利用，由于异丙醇与底物存在竞争性抑制作用，导致最大转化 率受到影响，并且副产物丙丽的生成难W除去并对酶有一定的损害作用。
[0006] (S)-4-氯-3-羟基下酸己醋和6-氯基-(3R，5R)-二羟基己酸叔下醋是HMG-CoA 酶抑制剂阿巧伐他汀类药物的侧链手性中间体，可W通过化学合成和生物催化合成的方法 获得。（S)-4-氯-3-羟基下酸己醋的化学法合成中也需要使用手性金属催化剂，生产成本 高；而在6-氯基-(3R，5R)-二羟基己酸叔下醋的化学法合成中则需要使用易燃易爆的正 下基裡、测焼，并且需要在<-65 C低温条件下进行，能耗大，再加6-氯基-(3R，5R)-二羟基 己酸叔下醋非对映诱导不充分，产物的光学纯度难W达到要求。近年来，利用酶法代替化学 法改善反应条件，降低反应成本，提高产物的选择性成为关注的重点。生物法不对称还原 合成（S)-4-氯-3-羟基下酸己醋的报道较多，涉及到的酶也较多，具有较高的选择性和活 性的菌株有：Geotrichum candidum、Pichia stipitis、Candida albicans、Streptomyces coelicolor、Candida parapsilosis ATCC 7330 W及 Steptomyces coelicolor 等。Wang 等研究了 Str巧tomyces coelicolor中的撰基还原酶催化该反应，同时将异丙醇作为辅助 底物形成辅酶循环体系，并且利用水/甲苯两相催化体系，最终将底物浓度提高到3. 6M， 2化内完全转化，产率达93%, ee〉99%。You等利用Candida parapsilosis SCR2催化该 反应，底物浓度IM时，转化化后，产率提高到95. 3%，ee为99%。化等利用基因挖掘技 术得到了两种新的还原酶，不对称还原4-氯己醜己醜己醋生成（S)-4-氯-3-羟基下酸己 醋，底物浓度为3M，产率提高到99%，选择性也有了进一步的提高（ee〉99. 9% )，为实现工 业化生产奠定了基础。此外，Codexis公司专利US7807423B2也公开了一系列丽还原酶，催 化生产（S)-4-氯-3-羟基下酸己醋，ee〉99%。6-氯基-(3R，5R)-二羟基己酸叔下醋是阿 巧伐他汀的另一种手性中间体，目前高立体选择性催化（时-6-氯基-5-羟基-3-撰基己酸 叔了醋生成6-氯基-(3R, 5R)-二羟基己酸叔了醋的菌株有；Saccharomyces cerevisiae、 Pichia angusta> Pichia haplophila> Beauveria bassiana> Pichia pastoris> Pichia membranefaciens、Candida humicola、Kluyveromyces drosophilarum、Rhodotorula glutinis 和 Pichia caribbic 等。Codexis 公司专利 US7879585B2 从 Saccharomyces cerevisiae中克隆了一种丽还原酶并进行了改造，催化生产6-氯基-(3R, 5R)-二羟基己酸 叔下醋转化率为99. 7%，de〉99%。
[0007] 依泽替米贝（Ezctimibc，Ezclr〇r )，化学名l-(4-氣苯基）-(3时-巧-(4-氣苯 基）-(3巧-羟基丙基]-(4巧-(4-羟基苯基）-2-丙内醜胺，是一类新型的选择性胆固醇吸 收抑制剂，由Merk公司研制，2002年首先在德国上市。该药物能与肠道中的胆固醇吸收 转运载体NPC1L1结合，从而有效降低密度脂蛋白胆固醇（LDkC)的含量，选择性抑制食物 W及胆汁中的胆固醇在小肠的吸收。化合物（4巧-3-[巧巧-5-(4-氣苯基）-5-羟基戊醜 基]-4-苯基-1，3-氧氮杂环戊焼-2