专利名称：拟南芥人工miRNA基因干涉载体快速构建方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，主要是一种拟南芥人工miRNA基因干涉载体快速构建方法。
背景技术：
现有的方法构建拟南芥基因沉默载体以Overlapping PCR为核心，通过PCR替换拟南芥miR319a的方法构建拟南芥基因沉默载体(Sctwab et al.，2006)。现有方法针对单个沉默载体构建需采用四条带有沉默相关序列的PCR引物，和两条公共引物配合，对 PRS300载体进行扩增，对扩增获得的3段DNA片段进行回收，再进行融合PCR，连入T载体， 酶切后再连入转化载体，最终获得转基因用的沉默载体。方法具体分为四个步骤第一步，通过针对每个不同的基因干涉设计合成4条长度为40bp的引物，合成两条公共的引物组合，用于扩增基因特异的沉默相关DNA片段；第二步，通过4条基因特异的沉默引物和两条公共引物祝贺，分别扩增获得三段长度为271bp，173bp, 299bp的DNA片段，通过电泳分离DNA片段，切割含目标大小DNA的凝胶，进行DNA片段回收；第三步，将回收得到的三段PCR产物混合，再用两条公共进行融合PCR，获得长度为6%bp的DNA片段，通过电泳分离DNA片段，切割含目标大小DNA的凝胶，进行DNA片段回收；第四步，将回收后的695bp片段连接到T载体或其他中间载体，通过连接、转化获得携带有相应载体的大肠杆菌菌落，扩增菌体后，抽取带有沉默片段的中间载体，再采用限制性内切酶进行酶切，获得有粘性末端的DNA片段，再和目标载体进行连接，通过连接、转化获得携带有转化载体的大肠杆菌菌落，测序检测正确后，用于农杆菌转化。现有方法构建载体需要四个大的步骤，且每个步骤操作的内容又相当繁琐，需要实验人员具有一定的分子生物学操作基础。本专利涉及的方法只需要两个步骤，并且每个步骤操作也非常简单，具有简单分子生物学基础的实验人员也能快速，准确的完成载体构建任务。
发明内容
本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种拟南芥人工miRNA基因干涉载体快速构建方法，尤其涉及拟南芥快速沉默载体改造用DNA序列和该DNA序列的合成以及采用该DNA序列用于建立高效的拟南芥人工miRNA基因干涉载体。为了解决上述的存在的技术缺陷，本发明的第一个目的是提供拟南芥快速沉默载体改造用DNA序列及其合成方法，本发明的第二个目的是提供用于高效构建拟南芥基因沉默载体的载体及其制备方法，本发明的第三个目的是提供拟南芥基因沉默载体及其制备方法。本发明简化了单个沉默载体构建的方法，加速了构建过程，提高了载体构建的效率。为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案
拟南芥快速沉默载体改造用DNA序列，该DNA序列如SEQ ID NO 1所示，SEQ ID NO 1所述如下caaacacacgctcggacgcatattacacatgttcatacacttaatactcgctgttttgaattgatgttt tAGGCCTagcgcTACGTAtccaattttcttgattaatctttcctgcacaaaaacatgcttgatccactaagtgacat atatgctgccttcgtatatatagttctggtaaaattaacattttgggtttatctttatttaaggcatcgccatg其中，AGGCCT部分为MuI酶切位点，TACGTA为SnaBI酶切位点。上述的拟南芥快速沉默载体改造用DNA拼接方法合成，该方法采用拟南芥 miR319a基因沉默序列作为基础，如SEQ ID NO :2所示，将此拟南芥序列分成首片段、尾片段和核心沉默片段(如图2所示)，通过连接融合首片段、接头片段和尾片段，然后用于快速基因沉默载体改造。SEQ ID NO 2 所述如下caaacacacgctcggacgcatattacacatgttcatacacttaatactcgctgttttgaattgatgttt taggaatatatatgtagagagagcttccttgagtccattcacaggtcgtgatatgattaattagcttccgactcatt catccaaataccgagtcgccaaaattcaaactagactcgttaaatgaatgaatgatgcggtagacaaattggatcat tgattctctttgattggactgaagggagctccctctctcttttgtatccaattttcttgattaatctttcctgcaca aaaacatgcttgatccactaagtgacatatatgctgccttcgtatatatagttctggtaaaattaacattttgggtt tatctttatttaaggcatcgccatg tagg ；
首片段如SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 5所述如下
caaacacacgctcggacgcatattacacatgttcatacacttaatactcgctgttttgaattgatgttt
尾片段，SEQ ID NO 6 SEQ ID NO 6所述如下
gtatccaattttcttgattaatctttcctgcacaaaaacatgcttgatccactaagtgacatatatgct gccttcgtatatatagttctggtaaaattaacattttgggtttatctttatttaaggcatcgccatg ；接头片段，SEQ ID NO 7所述如下cctagcgctac通过序列分析和设计，使得其中首片段由AGG位点结尾，而干涉尾片段由GTA位起始。这样首片段、连接片段和尾片段拼接获正好获得一个包含MuI酶切位点和SnaBI酶切位点的沉默载体改造用DNA序列，同时首片段的前端和尾片段的尾端包含了酶切位点及相应的保护碱基，用以酶切并连接改造的目标载体。作为优选，上述的拟南芥快速沉默载体改造用DNA序列的合成方法，包括以下的步骤①引物合成合成8条引物，序列如下
权利要求
1.一种拟南芥快速沉默载体改造用DNA序列，其特征在于该DNA序列如SEQ ID NO 1所示，SEQ ID NO 1所述如下caaacacacgctcggacgcatattacacatgttcatacacttaatactcgctgttttgaattgatgttttAGGCCTagcgcTACGTAtccaattttcttgattaatctttcctgcacaaaaacatgcttgatccactaagtgacatatatgctgccttcgtatatatagttctggtaaaattaacattttgggtttatctttatttaaggcatcgccatg ； 其中，AGGCCT部分为MuI酶切位点，TACGTA为SnaBI酶切位点。
2.一种合成如权利要求1所述的拟南芥快速沉默载体改造用DNA序列的方法，其特征在于该方法采用拟南芥miR319a基因沉默序列作为基础，如SEQ ID NO 2所示，将此拟南芥序列分成首片段、尾片段和核心沉默片段；首片段的序列如SEQ ID NO :5所示，尾片段的序列如SEQ ID NO :6所示；设计接头片段如SEQ ID NO :7所示，在首片段的前端和尾片段的尾端设计了酶切位点及相应的保护碱基；将首片段、接头片段和尾片段拼接获得一个包含MuI和SnaBI酶切位点的沉默载体改造用DNA序列，其中首片段由AGG位点结尾，而干涉尾片段由GTA位起始。
3.根据权利要求2所述的拟南芥快速沉默载体改造用DNA序列的合成方法，其特征在于该方法包括以下的步骤①「引物合成合成8条引物，序列如下 引物名称引物序列amiR-FlatgaattcctgcagccccaaacacacgctcggacgcatattacacatgttcatamiR-F2ttgatgttttaggcctagcgctacgtatccaattttcttgattaatctttcctgamiR-F3agtgacatatatgctgccttcgtatatatagttctggtaaaattaacattttggamiR-RlggcctaaaacatcaattcaaaacagcgagtattaagtgtatgaacatgtgtaatamiR-R2agcatatatgtcacttagtggatcaagcatgtttttgtgcaggaaagattaatcamiR-R3agggatccccccatggcgatgccttaaataaagataaacccaaaatgttaatttG-F-SaclTCGAGCTCatgaattcctgcagccccaacG-R-KpnlTCGGTACCagggatccccccatggcgatg②采用分步分段合成改造片段采用分步合成的方法合成此片段，amiR-FU amiR-Rl、amiR-F2和amiR-R2合成前端片段，amiR-F2、amiR-R2、amiR-F3 和 amiR-R3 合成后端片段； 合成前段和后段PCR体系浓度和反应条件为试剂加入量浓度H2O33.5ul/PCRBuffer5.Oul/dNTP5.Oul2. 5mMpb-Taq0.5ul/Primerl1.OulIOmMPrimer21.OulIOmMPrimer32.OulIOmMPrimer42.Oul lOmM温度 时间 循环 95 °C 2min / 95 °C 30" 34cycles 55 °C 30" 34cycles 72V 40" 34cycles 72 °C 7min / ③改造片段的拼接分别稀释100倍，再采用G-F-SacI和G-R-Kpnl引物用融合两段PCR产物，合成带有完 整改造片段的DNA链。
4.一种用于高效构建拟南芥基因沉默载体的载体，其特征在于该载体含有如权利要 求1所述DNA序列的基因片段。
5.根据权利要求4用于高效构建拟南芥基因沉默载体的载体制备方法，其特征在于 该方法包括以下的步骤①载体改造片段与目标载体的连接采用如权利要求1所述DNA序列的基因片段，再采用&icl和Kpnl内切酶酶切，如果目 标载体的采用其他的多克隆位点，则应在引物设计时，修改酶切位点，并在此处用相应的内 切酶进行酶切，然后连入未修改的目标载体，混合好后的连接体系在16°C水浴过夜；②改造完成的目标载体转化大肠杆菌取连接产物5ul，加入lOOul的CaCl2处理的DH5 a热击感受态，42°C热击处90秒，力口 入800ul的LB无抗培养基，在37°C用250rpm复苏1小时；在无菌条件下，取lOOul涂布在 含有50ug/ml卡那霉素的LB培养平板上，37培养培养16小时，挑选转化子，接入LB重新 培养后送测序确认；测序正确的菌采用25%甘油冻存，以备长期使用。
6.一种拟南芥沉默载体的快速构建方法，其特征在于采用以下两条引物 At—HESC—B—F tcacaggtcgtgatatgattaaAt—HESC—B—R tcaaagagaatcaatgatccaa将引物稀释到lOuM，并进行PCR ；PCR产物即为桥接片段；桥接片段和权力要求4所述 载体相连接，获得拟南芥基因沉默载体。
7.根据权利要求6所述的拟南芥沉默载体的快速构建方法，其在于该方法包括以下的 特征步骤①「质粒准备及线性化将权利要求4获得的载体摇菌扩增，采用质粒抽提试剂盒进行质粒DNA抽提，然后用 StuI和SnaBI酶切质粒；在37 下酶切过夜，酶切后的DNA采用1 %琼脂糖凝胶电泳，用溴乙锭染色后在紫外灯 下切胶，采用凝胶回收试剂盒回收酶切产物；②桥接片段的合成 用以下两条引物引物名称引物序列At_HESC_B_F tcacaggtcgtgatatgattaaAt_HESC_B_R tcaaagagaatcaatgatccaa将引物稀释到10uM，并进行PCR ；PCR产物即为桥接片段，桥接片段和权力要求4所述载体相连接，获得拟南芥基因沉默载体；③核心沉默片段的扩增为每个基因分别合成基因沉默相关片段引物两条首先，设计人工miRNA序列，将设计获得的人工miRNA片段反向互补，将3位、 14 位和 21 位进行 G-A，C-A, T-A, A-T 颠换，并在 5’ 增加 “aatatatatgtaga”，3’ 增加 "tcacaggtcgtgata",形成At_HESH_F ；将设计获得的人工miRNA片段反向互补，并在5’增力口 “aaaagagaga，，，3，±曾力口 “tcaaagagaatcaa，，形成特异弓I物 At_HESH_R ；④核心沉默片段与载体的连接无需进行回收，直接将扩增获得的片段PCR产物直接和已经线性化的载体相连接，混合好后的连接体系在16°C水浴过夜；⑤转化大肠杆菌菌株取连接产物5ul，加入IOOul的CaC12处理的DH5 α热击感受态菌，42°C热击处理90秒， 加入800ul的LB无抗培养基，在37°C用250rpm复苏1小时；在无菌条件下，取IOOul涂布在含有50ug/ml卡那霉素的LB培养平板上，37°C培养培养16小时，挑选转化子，接入LB重新培养；⑥基因沉默载体的检测检测引物的合成，需合成两条检测用引物引物名称引物序列Promoter—test—FgattgatgtgatatctccacAt—amiR—test—Rtatttggatgaatgagtcgg菌液PCR检测，将连接后的平板，挑选克隆摇菌，过夜培养后，取Iul进行菌液PCR检测，PCR确认的阳性克隆即可初步判断为转化克隆。
8. 一种拟南芥快速基因沉默载体，其特征在于该载体由权利要求5所述的载体通过权利要求7所述的方法构建获得。
全文摘要
本发明涉及一种拟南芥人工miRNA基因干涉载体快速构建方法，完成拟南芥沉默载体构建，主要是针对不同基因修改沉默片段，其他部分都是相同的，扩展了目标载体上不变的DNA区间，将沉默相关片段两端的不变区域事先放入转基因目标载体，再将核心沉默片段连入改造后的载体，直接完成载体构建。在首、尾片段选择时，分析了DNA序列，使得首尾片段通过桥接片段相连后可获得一个StuI酶切位点和一个SnaBI酶切位点，转化大肠杆菌后，可大量制备该载体并用StuI和SnaBI酶内切酶对其进行线性化，直接连接采用本专利方法合成的核心沉默片段，完成拟南芥沉默载体的构建。本发明有益的效果简便易行，操作方便，效益高，能够极大缩短实验时间，降低单个沉默载体的改造成本。
文档编号C12N15/63GK102268434SQ201110048020
公开日2011年12月7日 申请日期2011年2月23日 优先权日2011年2月23日
发明者严成其, 余初浪, 周洁, 杨勇, 王栩鸣, 程晔, 陈剑平 申请人:浙江省农业科学院