拟南芥pol2a基因在减数分裂重组中的功能及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及植物基因在减数分裂重组中的功 能，以及利用该基因的功能，在改变农作物育种进程中的应用，尤其是改变自然条件下很难 发生交换的区间，能够更加有效的加快育种效率。
【背景技术】
[0002] 减数分裂是真核生物有性繁殖所必需的生命过程，在减数分裂过程中DNA复制一 次，细胞分裂两次，使分别来自父母的一对同源染色体发生分离；而非同源染色体则自由组 合，由此产生了具有多种遗传组合的、染色体数目减半的配子，配子融合之后形成的合子保 持了亲本中染色体的数目，从而保证了遗传物质的稳定性，使物种得以繁衍。同源染色体识 别和配对、联会和交换是减数分裂前期中的重要事件，这些事件正常有序的完成确保了二 价体的正确形成和同源染色体的精确分离。因此，同源染色体前期相互作用是国内外植物 生殖发育领域的研宄热点之一，也属于前沿性的基础研宄工作。这个过程中发生的两次DNA 合成：减数分裂之前S期的全基因组水平DNA复制与以重组为目的的受调控的DNA双链断 裂修复（Double Strand Break Repair，DSB)，虽然在合成量上较前者少，但是该过程同样 对保证遗传信息传递的完整性，重组的正常发生至关重要。
[0003] 减数分裂核心事件是同源染色体间的相互作用，同源染色体的相互作用包括同源 染色体的配对、联会、重组和分离。其中，在减数分裂过程中重组发生在同源染色体之间，而 不是发生在姊妹染色单体之间，该过程与有丝分裂中发生的重组过程有所不同。在真核生 物中减数分裂的重组由介导的双链断裂起始，拟南芥中发现了 3个5^77同源基因， 即么据已有的报道，与是减数分裂 重组起始所必需，与DNA修复相关（Grelon et al·，2001; Yin et al·，2002)。 SPOll介导的双链断裂形成后，在断裂的双链两端经加工均可产生3'末端的单链DNA尾巴， RAD51相关的重组酶与该单链DNA结合并形成核苷酸-蛋白质纤维，该结构帮助同源染色体 间同源区的识别并入侵双链，RAD51家族的基因在该过程发挥了重要的功能，在拟南芥中有 3个似/?57家族基因（和JixrccJ)会导致减数分裂异常，这三个突变体 的营养生长正常但败育，败育均由于减数分裂过程中SPOll造成的双链断裂不能修复，造 成大量的 DNA 碎片（Bleuyard et al·，2004; Li et al·，2004; Li et al·，2005)。为 了保证染色体的精准分离，每个染色体至少需要一个交换(该交换成为必须交换)，但是交 换位点的分布并不随机，同一个染色体上的多个交换位点也会有相互间隔，交叉的数目和 分布对减数分裂过程中同源染色体的正确分离起到重要作用。这个现象又涉及到另一个现 象一一干涉，即一个交换产生后，该交换附近产生另一个交换的可能性会降低，这就是干涉 敏感型交换（type I COs)，主要依赖和细菌MutS蛋白同源的两个蛋白MSH4/5;同时存在着 另一种随机分别的交换，称为干涉不敏感型交换（type II COs)，主要依赖形成异源二聚物 内切酶MUS81和MMS4/EME1亚单元（Ma, 2006);另外还有非染色体交叉途径（NC0)。
[0004] 减数分裂重组过程主要包括DNA双链断裂、链末端加工、链入侵、链的合成和解 离，形成交换和非交换。其中，DNA合成是减数分裂重组中必不可少的一个环节。现有的研宄 已经发现若干参与DNA半保留复制过程的重要组件也为减数分裂必需。一个在人和酿酒酵 母中参与了复制起始的基因仰05也是拟南芥中减数分裂前S期DNA复制所必需（Stevens et al. 2004);同样作为DNA复制起始必需的微小染色体维持蛋白2-7 (Mini-chromosome maintenance, #Ofi_7)的同源基因 JOS在人和爪蟾中也已知参与了 DNA复制（Maiorano et al. 2005; Volkening et al. 2005)，最近的报道表明了 JOS伺样为拟南芥的减数分 裂所必需（Crismani et al. 2013);对DNA复制过程中负责后随链合成的DNA聚合酶δ的 研宄表明，缺失了最末四个残基的酿酒酵母突变体能完成正常的有丝分裂，但是却导致了 减数分裂重组频率的显著下降，推断原因可能是参与了酵母中减数分裂DNA双链断裂修复 (Maloisel et al. 2004);对负责PCNA加载的复制因子C (7?凡7)的研宄发现该基因参与 依赖于MSH4的干涉敏感型途径的CO的形成，推测DNA后随链的合成在减数分裂同源重组 过程DNA双链断裂修复中有重要作用（Wang et al. 2012)。因此通过寻找同样是DNA复 制必需的DNA聚合酶ε的不影响有丝分裂过程的非致死突变体，我们试图研宄DNA聚合酶 ε在减数分裂中可能存在的功能。
[0005] DNA聚合酶印silon (P0L ε )是一个在真核生物中保守，并含有多亚基的聚合酶。 其除了作为三个聚合酶之一，具有DNA聚合酶的基本功能：负责DNA的合成和染色体的复 制。聚合酶epsilon还参与多种重要的细胞过程，包括DNA损伤修复、DNA重组和适当的调 节细胞周期进程。而且，近几年的研宄工作表明，聚合酶epsilon还参与染色质重塑和表观 遗传调控。 DNA聚合酶epsilon对于DNA复制过程中复制叉的形成，进行和稳定有关键作用 (Pursell et al. 2008)。酵母中DNA聚合酶epsilon包含一个催化亚基和三个调节亚基， 这种结构在其他生物中相对保守。酵母中DNA聚合酶epsilon的最大亚基P0L2,为催化亚 基的合酶，在DNA复制过程中接替DNA聚合酶alpha完成前导链DNA的合成。
[0006] 拟南芥中，基因编码DNA聚合酶印Silon的催化亚基。研宄发现拟南芥 的非致死突变体表现对脱落酸（ABA)过度敏感，表明DNA聚合酶epsilon在ABA信 号转导中起作用；而且这个突变体的体细胞同源重组频率有一个60倍的上升，还表现出 DNA损伤修复敏感性增强、基因沉默位点激活、组蛋白修饰水平改变等，证明了 DNA聚合酶 印silon在同源重组和表观遗传调控中有重要作用（Yin et al. 2009)。
[0007] 拟南芥的突变体中还表现出DNA复制过程S期的延长，有科学家指出这可 能导致双键断裂（DSB)形成的增加 （Jenik et al. 2009)。而DSB的产生原因之一就是减 数分裂时期产生的交叉互换，最主要的修复DSB的方式就是同源重组，而已有研宄表明DNA 聚合酶epsilon参与同源重组过程，因此DNA聚合酶epsilon在同源重组方面的作用和机 制还有待进一步研宄。
[0008] 裂殖酵母中，DNA聚合酶epsilon的催化亚基Cdc20 (其在人类和酵母中具有广 泛同源性）和Dos2、Rikl、Mmsl9组成一个沉默复合物，在异染色质中调节RNA聚合酶Π 活 性，是DNA复制和异染色质组装所必须。异染色质的组装需要在S期的进程中进行，并且研 宄表明在植物和动物中，异染色质的沉默需要DNA复制和DNA聚合酶epsilon (Li et al. 2011)〇
[0009] DNA聚合酶epsilon的核心作用在于参与DNA合成和染色体的复制，保证了复制叉 的形成和稳定。而且其在异染色质形成、基因沉默、同源重组、DNA损伤修复等方面有重要 作用，这些过程的正确进行对于真核生物减数分裂进程是必不可少的，保证了真核生物的 基因组和遗传信息能够稳定的遗传给子代，因此对于DNA聚合酶印silon参与减数分裂同 源重组机制的研宄，有助于进一步解析植物减数分裂同源重组过程，为农作物育种提供理 论基础。目前，有关DNA聚合酶epsilon在同源重组和表观遗传调控方面是研宄热点，其具 体的调控机制，以及在不同物种之间的保守性都有待进一步研宄。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于通过研宄拟南芥P0L2A在减数分裂重组中的功能，并利用其功 能特性，结合现代生物学技术，有目的地定向改变作物的重组频率，以缩短作物遗传育种的 进程。
[0011] 本发明利用已知的拟南芥参与编码DNA聚合酶印silon (P0L ε )最大催化亚基的 基因 /^ZiM(ATlG08260)。该基因全长 15949bp (SEQ ID NO. l)，cDNA 编码区序列长 6486bp (SEQ ID NO. 2)，该基因编码2161个氨基酸（SEQ ID NO. 3)。通过对拟南芥和其它包括人、 小鼠、大鼠、果蝇、线虫、酵母6个物种P0L2氨基酸序列的比对，确定了 /??%的若干保守结 构域（图1B)，从N端到C端分别为：氮末端结构域、3' -5'外切酶活性结构域、5' -3'聚合 酶活性结构域、中央催化活性结构域、PCNA结合结构域和锌指结构域。
[0012] 本发明还提供/7oA?-2、/7oA?-J?与/7oA?-J三个突变体基因型鉴定的引物，如SEQ ID NO. 4-SEQ ID NO. 13所示，具体为：突变体/7〇以3-7基因型鉴定引物(基因组带):SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5,突变体基因型鉴定引物（T-DNA插入带）:SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7,突变体/?〇以3-之点突变测序引物：SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9,突变体/?〇以 基因型鉴定引物（基因组带）：SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 11，突变体基因型鉴定 引物（T-DNA 插入带）：SEQ ID NO. 12和 SEQ ID NO. 13。
[0013] 上述的三个突变体以3-7、/70以3-么/70以3-A由拟南芥生物资源中心（ABRC， 美国）提供，是拟南芥的三个突变体材料，分别为：SALK_096341C、CS6947与 SALK_124217。其中和突变位点在/??% N端，都位于了 3'-5'外切酶活 性结构域后保守区域，是氮端突变且纯合不致死的弱突变体（图2A)。是一个突变 位置在碳端PCNA结合结构域上的T-DNA插入突变，基因型鉴定不到纯合材料，是纯合胚胎 致死所致。即：两种纯合不致死的弱突变体：T-DNA插入突变体(插入位点位于第 12个外显子）和拟南芥基因的点突变体（突变位点位于第469个氨基酸）； 一种纯合胚胎致死的T-DNA插入突变体(插入位点位于第32个内含子)。
[0014] 本发明还涉及拟南芥基因的弱突变体/7〇以3-2和的植株表型和 雄性减数分裂异常，具体为通过植株的观察和细胞学实验，如成熟花粉粒亚历山大红染色， 四分体碱性品红染色和展片法观察突变体花粉母细胞减数分裂过程等实验确定了 /70/23-7 和的减数分裂异常表型。
[0015] 具体来说，/7〇以3-7和/7〇以3-4直株的表型，与野生型相比表现为：营养生长没有 明显差别，但是有性生殖期突变体比较野生型显示了明显育性上的差异：果荚短；花瓣瘦 长，花丝短（图2)，花药花粉量显著减少（图3A)。/7〇/为-7和/7〇/为-4直株的雄性减数分裂 表型，与野生型相比表现为：从细线期到粗线期