大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白病程关键靶基因及其干扰载体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白病程关键靶基因，还涉及含有所述硫胺素 转运蛋白病程关键靶基因的干扰载体，本发明还涉及所述大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白病程 关键靶基因或干扰载体在提高植物对大丽轮枝菌抗病性中的应用，属于大丽轮枝菌病程关 键基因的克隆及应用领域。
【背景技术】
[0002] 大丽轮枝菌（Verticillium dahliae)是一种土传维管束真菌病害，侵染范围非常 广泛，能侵染包括木本植物、草本植物和藤本植物在内的两百多种经济作物，给中国乃至世 界造成极大的经济损失。鉴于其严重的危害性，探宄大丽轮枝菌致病机理和寄主与病原菌 之间的相互作用机制一直是研宄的热点。如何提高寄主植物体对大丽轮枝菌的抗病性是急 待解决的问题。
[0003] 残留在土壤中的大丽轮枝菌微菌核受到植物分泌液的诱导而萌发，萌发的微菌核 不需要任何的吸附结构直接定殖在植物根的表面并渗透到表皮细胞的皮层中去（Reusche Mj Thole Kj Janz D，Truskina J，Rindfleisch Sj Drlibert C，Polle A，Lipka V，Teichmann T:Verticillium infection triggers VASCULAR-RELATED NAC D0MAIN7-dependent de novo xylem formation and enhances drought tolerance in Arabidopsis. Plant Cell 2012, 24:3823 - 3837 ；Zhao PjZhao Y-LjJin YjZhang TjGuo H-S:Colonization process of Arabidopsis thaliana roots by a green fluorescent protein-tagged isolate of Verticillium dahliae. Protein Cell 2014,5:94 _98·)。渗透到植物表皮细胞的菌丝穿 过细胞壁在根部的细胞内和细胞间生长并延伸到根部的维管束组织，改变植物体细胞的 内生环境，形成一种共生环境（?688,6.?.，311(18以(17,8.1^(2002)./61^;!_(3；!_11;!_11111?;!_1七8· (Wellingford, UK:CABI Publishing) ；Klosterman SJ，Atallah ZKj Vallad GE,Subbarao KV:Diversity，pathogenicity，and management of Verticillium species.Ann Rev Phytopathol2009, 47:39 - 62.) ^在共生环境中，植物体阻碍菌丝体的入侵，而菌丝体利 用共生环境中的营养物质维持菌丝体的入侵和孢子的产生与释放（Fradin EF，Thomma BP:Physiology and molecular aspects of Verticillium wilt diseases caused by V. dahliae and V.albo-atrum· Mol Plant Pathol 2006,7:71 - 86·)。释放到维管束的抱 子可以通过植物体的蒸腾作用向上运输，被运输到维管束壁的孢子萌发形成萌发管，向植 物体细胞渗透、定殖、侵染和繁殖。
[0004] 目前为止，大丽轮枝菌致病机理仍停留在初步探索阶段。大丽轮枝菌定殖在寄主 植物体内，如何适应寄主体内的细胞内环境和如何吸收寄主细胞内营养成分至今还没报 道。因此，探索大丽轮枝致病机制过程中入侵繁殖机制显得更加重要，寻找到参与吸收过程 中关键的蛋白因子，"反向基因组学"为培育抗病的新材料品种提供了一条新的技术路线。
[0005] 硫胺素也叫维生素 B1，是一种可溶性的B族维生素，作为很多重要的辅酶在细胞 的物质和能量代谢过程中起着重要作用，是生物体必须的营养物质。硫胺素在真菌的营 养生长、入侵、生殖生长过程中必不可少的营养成分。通过质膜上的硫胺素转运蛋白将环 境外的硫胺素转运到细胞内是真菌微生物获得硫胺素的主要方式（Mojzita D.，Hohmann S.Pdc2coordinates expression of the THI regulon in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular genetics and genomics，2006, 276 (2) : 147-16L ) 〇 石荒胺素车专运 蛋白（Thiamine transporter)是一个质膜蛋白，属于还原型的叶酸转运蛋白家族，包含膜 嵌入底物结合蛋白、两个ATP结合蛋白和一个转运蛋白亚基（Lagarde, W. H.，Underwood, L. E. , Moats - Staats, Β. Μ. , &Calikoglu, A.S. (2004). Novel mutation in the SLC19A2gene in an African - American female with thiamine - responsive megaloblastic anemia syndrome. American Journal of Medical Genetics Part A, 125 (3) ,299-305·)。主要将 外界低浓度的硫胺素转运到生物体内，供机体进行新陈代谢。
[0006] 目前有关大丽轮枝菌的硫胺素转运蛋白的研宄还未见任何报道，从硫胺素转运蛋 白基因中筛选得到病程关键靶基因对于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性将具有重要的意 义。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供大丽轮枝菌（Verticillium dahliae)的硫胺 素转运蛋白病程关键靶基因以及含有所述硫胺素转运蛋白病程关键靶基因的RNA干扰载 体；
[0008] 本发明所要解决的另一个技术问题是将所述硫胺素转运蛋白病程关键靶基因的 RNA干扰载体应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0010] 本发明首先公开了大丽轮枝菌（Verticillium dahliae)的硫胺素转运蛋白病程 关键靶基因，其核苷酸序列为 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4 或 SEQ ID No. 5所示；优选的，所述硫胺素转运蛋白病程关键靶基因，其核苷酸序列为SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4 或 SEQ ID No. 5 所示。
[0011] 本发明还公开了含有所述的硫胺素转运蛋白病程关键靶基因的RNA干扰载体以 及含有所述RNA干扰载体的宿主细胞。
[0012] 本发明所述硫胺素转运蛋白病程关键靶基因能够应用于提高植物对大丽轮枝菌 的抗病性，包括以下步骤：（1)构建含有所述硫胺素转运蛋白病程关键靶基因的RNA干扰载 体；（2)将所构建的RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（3)筛选获得对大丽轮枝菌抗 病性提高的转基因植物。
[0013] 本发明所述RNA干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性，包括以下 步骤：（1)将所述RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（2)筛选获得对大丽轮枝菌抗病 性提尚的转基因植物。
[0014] 本发明进一步公开了一种培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种的方法，包括以 下步骤：（1)构建含有所述硫胺素转运蛋白病程关键靶基因的RNA干扰载体；（2)将所构建 的RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基 因植物新品种。
[0015] 所述转化的方案以及将所述核苷酸引入植物的方案可视用于转化的植物或植物 细胞的类型而变化。将所述核苷酸引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆 菌介导的转化、直接基因转移等。
[0016] 本发明所述植物为大丽轮枝菌的寄主植物，优选为农作物，包括：烟草、棉花、番 茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种或多种。
[0017] 本发明通过病毒诱导的基因沉默技术（VIGS)将大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因 的 5 段靶基因序列 Thitl (SEQ ID No. 1 所示）、Thit2 (SEQ ID No. 2 所示）、Thit3 (SEQ ID No. 3所示）、Thit4(SEQ ID No. 4所示）、Thit5(SEQ ID No. 5所示）导入本生烟中，使其瞬 时表达dsRNA，并进行大丽轮枝菌接种，观察本生烟植株的感病症状，并对其进行病情指数 分析。结果发现，导入5段靶基因片段的本生烟植株的抗病性都显著提高，在接菌第12天 后，导入干扰基因的本生烟植株感病症状不明显，仅下面叶片出现萎焉，上面叶片没出现感 病症状，植株整体没有出现萎焉、枯死症状。同时，导入5段靶基因的本生烟植株的感病症 状之间也存在差异，导入基因片段Thit2、Thit4、Thit5的本生烟植株的感病症状低于导入 基因片段Thitl、Thit3的本生烟植株，植株对大丽轮枝菌的抗病性更强。病情指数统计结 果发现，注射靶标基因片段的本生烟草，病情指数均显著低于空载。
[0018] 本发明在筛选出抗病表型明显的大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因的三段基因片 段Thit2、Thit4、Thit5的基础上，利用Gateway技术，构建硫胺素转运蛋白三段靶基因序列 的稳定遗传干扰载体，转化本生烟，获得转基因的烟草植株。转靶标基因的本生烟植株的抗 病性实验结果表明，获得的三段不同靶基因（VdThit-l(SEQ ID No. 5所示）、VdThit-2(SEQ IDN0.4所示）、VdThit-3(SEQIDN0.2所示））的烟草转化植株对大丽轮枝菌的抗病性 与野生型相比显著提高，分别表现为高抗（病情指数在15 %以下），抗病（病情指数在 15-30% )，抗病。
[0019] 转靶标基因的本生烟植株接种大丽轮枝菌后，获得V