一种用于防治作物黄萎病的多粘类芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物种质资源的开发与利用领域，具体涉及一种用于防治大丽轮枝 菌引起的作物黄萎病的多粘类芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)属于子囊菌门真菌，主要以微菌核在土壤、 病残组织、带菌的种子和未经腐熟的土杂肥上越冬，可为害38科660种植物，其中大田作物 包括棉花、向日葵、前子、辣椒、番茄、烟草、马铃薯等，引起的病害称为黄萎病。越冬后的微 菌核萌发，产生大量的分生孢子，分生孢子萌发侵入根毛、根表皮细胞或根部伤口，经过皮 层进入导管，破坏植物的维管束系统，并在侵染过程中产生毒素，导致作物萎蔫死亡给农业 生产带来严重损失。病原菌产生的黑色微菌核具有抗逆性，且具有积累效应，可在土壤中可 存活多年，而引起的作物黄萎病是生产中最难防治的病害之一。
[0003] 长期以来，农业生产中防治黄萎病主要以培育抗病品种和使用化学杀菌剂为主， 但针对大丽轮枝菌的作物抗病性几乎没有获得完全抗病的品种。主要原因是大丽轮枝菌易 变异，新培育的抗病品种很快丧失了抗病性。生产上主要依赖化学杀菌剂，而大量使用化学 药剂对人类健康潜在的危害、对食品和环境的污染、对非靶标生物的影响以及导致病原菌 抗药性的加速发展等问题已经引起社会的日益关注，减量使用化学农药是发展的必然趋 势。
[0004] 随着随经济的发展和人类生活质量的提高，对农产品安全和农业的可持续发展越 来越关注，这也促使了生物防治的发展。几年来国内外大量研究表明，利用拮抗微生物研发 生防制剂，具有广阔的前景。一方面，微生物种群丰富，而且可通过生物工程技术大幅度提 高目标活性物质的产量，易于实现工业化生产；另一方面，微生物制剂本身来源于自然界， 易于降解，对环境友好、安全，已有大量的生防产品应用于植物病害防治。
[0005] 在病害防治中，研究集中于芽孢杆菌研发和利用。这是因为芽孢杆菌能分泌多种 拮抗化合物，能有效抑制多种植物病原菌。由于这类细菌拥有芽孢，它们对辐射、热、干燥、 极端pH值和一些有毒化学物品等有很强的抵抗能力，在一定条件下，内生芽孢在休眠状态 下可以保持活力数年至数十年之久；同时，内生芽孢繁殖速度快、营养要求简单和易于在植 物根圈定殖的特点，因而利用这些细菌研发的生防制剂已被广泛应用于植物病害的防治方 面。我国芽孢杆菌BI30制成的泥炭制剂对生姜青枯病以及枯草芽孢杆菌TG26对烟草青枯病 防效达90%以上。多粘类芽孢杆菌属芽孢杆菌类，其拮抗机制主要是分泌的拮抗化合物、溶 菌酶等。然而，不同的种类，甚至同种的不同来源株系间的拮抗效果差异很大。
[0006] 虽然国内外都已有多粘类芽孢杆菌制剂，但由于菌株的多样性，不同多粘类芽孢 杆菌菌株仍具有不同的抗菌谱、抗菌活性和抗菌特点，筛选不同作用对象的高效菌株仍是 现在乃至今后相对长的一段时间内各国科研工作关注的方向。
【发明内容】
[0007]本发明提供了一种防治作物黄萎病的多粘类芽孢杆菌，该菌株对大丽轮枝菌引起 的棉花黄萎病的防效达86%以上。
[0008] -种多粘类芽孢杆菌，分类命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) SX-3,保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心 (CGMCC)，保藏日期为2015年11月11日，保藏号为:CGMCCNo. 11638。
[0009] 该菌株主要形态及生物学特征为:革兰氏染色反应阳性，菌体杆状，无鞭毛，大小 约为0.58μηιX2.9μηι，菌落表面光滑，呈乳白色。该菌株16SrDNA序列分析显不其与GenBank 号为JX849658.1或KR010176.1 的多粘类芽抱杆菌（Paenibacilluspolymyxa) -致性为 99% 〇
[0010] 本发明提供了一种含有所述多粘类芽孢杆菌的菌剂，该菌剂的浓度优选为1X107 ~1X108CFU/mL，更优选为1X108CFU/mL。
[0011 ]本发明提供了所述菌剂的制备方法，包括：
[0012]将所述多粘类芽孢杆菌接种于培养液中，培养至OD600为0.6~0.8，获得种子液； [0013]所述培养液可选用LB液体培养基，其配方为:胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化 钠1(^/1，调节口!1为7.0~7.2。
[0014] 将种子液接种于发酵培养基中扩大培养，调节发酵液中多粘类芽孢杆菌的浓度至 1X107~1X108CFU/mL，即获得所述菌剂。
[0015] 其中，所述种子液的接种量优选为1~2%;所述发酵培养基为:先将淀粉糊化，再 加入到含有酵母粉、蛋白粉、葡萄糖、MgS04、KH2P04、CaC03的培养基中，121°C灭菌30分钟。
[0016] 本发明中，所述扩大培养是在发酵罐中进行，培养本发明菌株时的温度、PH、通气 量、罐压、转速等条件没有特别严格的要求，只要该条件适合所述菌生长即可。在一些较佳 实施方案中，通气比为0.4~2:1，转速为300~800rpm，pH宜在6~7.5之间，培养温度宜在28 ~35°C之间，培养时间在48~72h之间。最终菌浓度通常可达1X101()~1X10nCFU/mL，调节 菌悬液浓度至1X1〇7~1X108CFU/mL施用。
[0017] 本发明提供了所述多粘类芽孢杆菌在拮抗大丽轮枝菌中的应用。
[0018] 在平板拮抗试验中，本发明菌株对大丽轮枝菌孢子萌发的抑菌圈直径为4.2cm，对 菌丝生长的抑制率达75%，菌丝被抑制后不能形成轮枝，出现明显的膨大、消解等畸形现 象。
[0019] 本发明提供了所述多粘类芽孢杆菌在防治作物黄萎病中的应用。
[0020] 所述作物可以是棉花、向日葵、茄子、番茄、烟草或马铃薯，优选为棉花。
[0021] 防治棉花黄萎病可以按如下方法操作：在棉花3~4叶期，将所述菌剂浇在苗床上 或对植株灌根处理，防治5天后接种大丽轮枝菌，接种20天后，防效仍达86%以上;或将所述 菌剂灌根于已发病植株，一周后，病株茎基部维管束变褐症状消失。
[0022]本发明多粘类芽孢杆菌对大丽轮枝菌具有高效拮抗作用，能用于大丽轮枝菌引起 的作物黄萎病的防治，棉花盆栽试验防效达86%以上;且作物发病后期，用包含有本发明菌 株的菌液灌根，仍具有明显的治疗效果，所以，本发明菌株作为生物农药应用具有很大的潜 力。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明多粘类芽孢杆菌的菌落特征图；
[0024] 图2为本发明多粘类芽孢杆菌的电镜图；
[0025] 图3为本发明多粘类芽孢杆菌对大丽轮枝菌的分生孢子抑制作用图，左边实验组， 右边为对照组；
[0026] 图4为本发明多粘类芽孢杆菌对大丽轮枝菌菌丝的抑制作用图，左边为实验组，右 边为对照组；
[0027]图5为大丽轮枝菌菌丝生长被本发明多粘类芽孢杆菌抑制后的显微观察图；
[0028]图6为大丽轮枝菌菌丝生长被本发明多粘类芽孢杆菌抑制后的显微观察图。
【具体实施方式】
[0029]实施例1菌株分离筛选
[0030]供试土样采自河北农科院连作的棉花病苗圃和陕西省三元县西北农林科技大学 连作的棉花试验田中，随机采集土样于无菌袋中，密封后于4°C冰箱中保存。
[0031 ]双层平板法筛选土壤中的生防细菌。将培养4-5天的大丽轮枝菌打菌饼于无菌水 中，配制浓度为1〇6个/mL的孢子悬浮液。取适量（lg)土样于无菌水中配制成土壤悬浮液，系 列稀释至1(Γ2-1(Γ3。双层平板法:将配制的大丽轮枝菌孢子悬浮液均匀涂布PDA上，28°C下 生长48h后，倒LB于PDA上层，均匀涂布土壤悬浮液。将平板置于28°C黑暗条件下培养，待菌 落长出后，挑选有抑菌圈的菌落纯化培养，然后进行复筛。
[0032] 筛选共得到5个有生防效果的菌株，分别命名为SX-2、SX-3、SX-4、Hb-l、Hb-2。
[0033]生防菌株对孢子萌发的抑制作用
[0034]将初筛得到的菌株接种于LB培养液中培养至培养液OD600为0.6~0.8，获得菌液； 配制大丽轮枝菌的孢子悬浮液，加入到冷却至45°C的PDA中，混合均匀后倒平板，冷却。取高 压灭菌后的牛津杯，置于PDA中央，加入100yL的菌液，低温10°C下扩散2h后置于30°C培养箱 中培养。观察有无抑菌图形成，若有抑菌图形成，测量并记录抑菌圈直径。
[0035]不同菌株抑菌效果如表1所示。其中菌株SX-3的效果最显著。
[0036]表1生防菌株对孢子萌发的抑制作用。
[0038] 生防菌株对菌丝生长的抑制作用
[0039] 在PDA培养基中央接种大丽轮枝菌，在其菌落周围将细菌菌液呈三角形划线，置于 25°C培养箱下培养。7(1测定菌丝生长抑制率(生长抑制率=[(1?1-1?2)/1?1]\100%，其中，1?1 为对照病原菌的菌落半径;R2为接细菌的病