专利名称：一个可用于防治作物病害的编码Harpin－like蛋白的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物病害防治领域，更具体地，本发明涉及一种可用作控制甘蓝黑腐病的编码Harpin-like蛋白的基因。本发明还涉及该基因在植物病害防治中的应用以及作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用。
背景技术：
植物病害一直是农作物减产、品质降低的主要因子之一。随着病原菌对药物抗性的增强，农药用量在不断增加，这不仅加剧了环境污染、药物残留，也大大提高了农业成本，因此，亟待研发新的防病治病策略和新型的无公害药物。弄清植物病原菌侵染寄主的遗传机制是开发新型药物和防病策略的关键。
甘蓝黑腐病黄单胞菌，也称为甘蓝黑腐病黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris，简称Xcc)，是一种能在全球范围内引起所有十字花科植物黑腐病的革兰氏阴性细菌(Qian，2005)。该菌能在寄主的任何生长期通过水孔、气孔或伤口侵入植物体内，引起病害，寄主包括甘蓝、花椰菜、大白菜、萝卜、油菜等。典型的黑腐病症状是在叶缘上形成V字形病斑，随着病斑的扩大，叶脉变黑，因而被称为黑腐病。黑腐病被认为是对十字花科植物危害最为严重的病害，尤其在热带和亚热带地区，温度和湿度都适宜于该菌的生长繁殖，因此发病更加严重。由于遗传稳定性和遗传可操作性，甘蓝黑腐病黄单胞菌一直被用作研究微生物与植物相互作用分子机理的模式细菌。因此，鉴定与甘蓝黑腐病黄单胞菌致病相关的新基因，对防治植物病害具有显著的意义。
对病原侵染形成过敏性反应是植物本身的一种主动反应，被认为是自然界中植物抵抗病原侵染的最有效形式。通过基因工程手段探索利用过敏性反应防治植物病害的途径是一种新的尝试。细菌的蛋白质第III型分泌系统(Type Three Secretion System，简称TTSS)和通过该系统分泌转运的效应物，是病原细菌致病的决定性致病因子。TTSS是一种具有类似于注射器装置的分泌系统，植物病原细菌的TTSS由hrp致病岛编码。其中hrpW的产物是一种Harpin蛋白，具有果胶裂解酶(pectate lyases)结构域(Kim，1998)，HrpW先于HrpF被转运至寄主细胞壁，在细胞壁上形成穿孔，以便形成效应物转位子(Buttner，2002)。harpin蛋白可以直接引起植物的过敏性反应，提高抗病力(Kim，2004)。
发明内容
本发明鉴定了甘蓝黑腐病黄单胞菌编码Harpin蛋白的基因与致病相关，Harpin蛋白可广泛提高植物的抗病力，提供可能的防治植物病害的药物靶标。
因此，本发明的一个目的是提供一种编码Harpin-like蛋白的基因(XC3023基因)，其是下列核苷酸序列之一1)SEQ ID No.1所示的DNA序列；2)与SEQ ID No.1所示DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
在一个实施方案中，所述的基因具有SEQ ID No.1所示的DNA序列，5’端的第57-1028位核苷酸为开放阅读框。
本发明还涉及含有上述基因的表达载体。优选为pET3023。
本发明另一个目的是提供上述基因在植物病害防治中的应用。
在本发明的一个实施方案中，所述植物病害是由甘蓝黑腐病黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestfis)所导致的甘蓝黑腐病。
本发明还有一个目的是提供所述的基因作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用。在一个实施方案中，所述植物病害是由甘蓝黑腐病黄单胞菌所导致的甘蓝黑腐病。
SEQ ID No.1所示的DNA是甘蓝黑腐病黄单胞菌8004菌株的DNA，由1047个碱基组成。含完整的Harpin-like蛋白基因，自5’端的第57-1028位核苷酸为该基因的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自5’端的第57-59位核苷酸为该基因的起始密码子ATG，自5’端的第1029-1031位核苷酸为终止密码子TGA。
SEQ ID No.2所示的蛋白质是Harpin-like蛋白基因编码的Harpin蛋白产物，由324个氨基酸组成。该蛋白质预测分子量为33392.84道尔顿，等电点为5.64。
含有本发明开放阅读框及其部分序列的表达载体均属于本发明的保护范围。
图1为XC3023基因的克隆酶切电泳图谱。1100bp标准DNA(片段大小从大到小依次为3kb，2kb，1.5kb，1.2kb，lkb，0.9kb，0.8kb，0.7kb，0.6kb，0.5kb等)；2XC3023基因片段；3λ/HindIIl2标准DNA(片段大小从大到小依次为23.1kb，9.4kb，6.6kb，2.4kb，2.0kb)。
图2为XC3023基因插入突变体219C01的PCR验证凝胶图。1100bp标准DNA；2XC3023基因插入突变体219C01。
图3为XC3023基因插入突变体219C01的Harpin蛋白表型检测。AHarpin-like蛋白处理；B未处理。
图4为XC3023基因插入突变体219C01的致病性试验。A为甘蓝黑腐病黄单胞菌野生型菌株8004；B为XC3023基因插入突变体219C01；C为水(空白对照)。
具体实施例方式
下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例在本发明的实施例中所用到的材料包括甘蓝黑腐病黄单胞菌野生型菌株8004，购于英国植物病原细菌国家保藏中心(The National Collectionof Plant Pathogenic Bacteria，NCPPB)，保藏号为NCPPB No.1145；大肠杆菌(Escherichia coli)株系JM109、载体pGEM-3Zf(+)购自Promega公司，表达载体pET30a(+)购自Novagen公司，pLAFR3、pLAFRJ为本研究室保存的柯斯质粒(Staskawicz et al，1987)；限制性内切酶、修饰酶等试剂购自Promega、Stratagene、QIAGEN公司。
实施例1 甘蓝黑腐病黄单胞菌突变体库的构建以大肠杆菌和Xcc之间的穿梭质粒pLAFR1为载体将Tn5gusA5(Sharma，1991)引入Xcc野生型菌株8004，然后通过引入不相容质粒pPH1JI(Tang et al，2005)驱赶pLAFR1，通过抗生素(卡那霉素)抗性标记筛选Xcc::Tn5gusA5插入突变体，结合Xcc全基因组序列(基因组序列号NC 007086)和TAIL-PCR(Thermal Asymetric Interlaced-PCR)(Yao-Guang Liu，1995)技术，确定Tn5gusA5在基因组上的插入位置，并对插入位置进行PCR验证。通过考察突变体的致病性、胞外酶活性、胞外多糖合成等表型的变化，筛选致病相关基因(Tang et al，2005)，本发明涉及其中一个新的致病相关基因--XC3023基因(Harpin-like蛋白基因)，其插入突变体编号为219C01，筛选过程见参考文献(Tang et al，2005)。
实施例2 XC3023基因(Harpin-like蛋白基因)的克隆及序列测定根据XC3023的基因序列(见序列表，第1位到第1047位碱基)，设计引物(上游引物GGGGATCC ATGCAACGCATGCTCAGGGACATG和下游引物GGGAATTC GCCGCTGTAGGGCTGATGCC；PCR条件95℃3min；95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃5min)，以甘蓝黑腐病黄单胞菌8004菌株总DNA为模板，用PCR法扩增该基因全长ORF序列，并将其克隆至克隆载体pET30a(+)中，获得了含该基因的重组质粒pET3023。用双脱氧核苷酸法在ABI 377 DNA自动测序仪上测定DNA核苷酸序列(SEQ ID No.1)。该质粒用BamHI、EcoRI酶切，除了一个5.5kb的载体条带外，还有一个972bp的外源片段(见图1)。
实施例3 XC3023基因插入突变体219C01的验证对插入突变体219C01进行TAIL-PCR测序定位，发现其插在XC3023基因内。用转座子Tn5上gus基因侧的一条引物(TTGTAACGCGCTTTCCCACCAACGC)和上游基因XC3022(GenBank登录号YP_244090)的一条引物(5’-GAGCAGCACCCGATTCGAAGCG-3’)配对进行PCR验证(95℃3min；95℃30sec，60℃30sec，72℃90sec，30个循环；72℃5min)，产物预期大小1.3kb(见图2)。
实施例4 XC3023基因编码的Harpin-like蛋白提高辣椒抗病力检测将pET3023过量表达的Harpin蛋白纯化，高浓度(1克/升)喷洒在辣椒(Capsicum annuum)ECW 10R上。20小时后以辣椒斑点病菌(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)喷雾接种。结果表明，经Harpin蛋白处理的辣椒抗病力显著增强，表明XC3023基因编码的Harpin蛋白引起植物的过敏性反应，提高植物抗病力(见图3)。
实施例5 XC3023基因插入突变体219C01的致病性检测实验所用寄主植物为萝卜苗(种名为Raphanus sativus L.var.radiculusPers.)，所用的接种方法为剪叶法。XC3023基因插入突变体和野生型菌株在28℃下进行液体培养，培养基NYG(每升溶液含5g蛋白胨，3g酵母膏和20g甘油，根据三组分缩写为NYG，pH7.0)，15-18个小时。用NYG稀释到OD600＝0.001，用灭过菌的剪刀在菌液浸泡5秒钟后，在健康叶片距叶尖1-2cm垂直叶脉的方向剪到中轴处，停留5秒钟，被接种的植物在25-30℃培养一周后观察结果，正对照选用甘蓝黑腐病黄单胞菌野生型8004菌株，负对照用清水。致病试验表明，XC3023基因的插入突变体的致病性显著降低(见图4)。
从本实施例可以看出，本发明要求保护的基因的失活直接导致甘蓝黑腐病黄单胞菌致病力的下降。因此，本发明要求保护的基因可以用于植物病害防治，特别是由甘蓝黑腐病黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)所导致的甘蓝黑腐病。另外，本发明要求保护的基因可以作为开发用于植物病害防治的药物的靶标。本领域技术人员根据本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是甘蓝黑腐病的药物。
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序列表<110>广西大学<120>一个可用于防治作物病害的的编码Harpin-like蛋白的基因<130>IB055877<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1047<212>DNA<213>Xanthomonas campestris pv.campestris<400>1ccctttcgca gcagcaagcc ctgaccgcgg tgatcatgag catgctgacg tactgcatgc60aacgcatgct cagggacatg ctgcagccac aggatcagcc attcagcgac ggtcagccac120cgaccaaccc gaatccgaca ccaccgatgc cgccctcgcg cccgccctgt tccaccaacc180ccggcggaca acacggtagc ggtactggcg atggcagcgg cggcaatggc ggcaaccaca240acagaggcaa cggcggcacc tgcggaacgg gagccgatca ccgcgcatcg cccaccaacc300cgggtcaggc ggtgaggccc tgccccgatg gtccgcaggc cccacttcct cccggcaagg360tcgtcaccgc gccacccggc ctccagaaca agaccatcgt ggtgcataag ggcgaggtat420tcgacggcaa gggtcagacc tacatcggtg gccctggtct gggcgatggc tcccagaacg480aacaccagca gccgctgttc gtcgtcgagg acggcggtag cctgtgcaac gtcaacatga540agggcggcgg cgacggcgtg catttcatgg gcagcggcaa gatggtcaac tgcgtcaacg600acgatgtcag cgaggatgcg gtcaccatcg atggccaggg caaccgcgag catgatgcgc660gcattgccgg ttgtcgcccg gaggtcagcg gccggccgaa ggtcgacatc atcaattgca720cgttcaagaa tgccgcagac aaggtcgtgc aggacaatgg tgctgccgac gtggtgatgt780cgggttgcac cgtcaacggc gccggcaagg tctttcgtac caacggtgga cacgctgata840tcgacacgca tcttcaggtc gaaaattgcg atttccaaca ggtcaaggaa gcggtgttcc900gtaccgatgc gccgggcgcg acggtgaagc tggcaaacct gaagaccgat gcgcccgacg960aggtgattgc ccccagcgct ttccaggcca ccggagcgac ccgaatcggg catcagccct1020acagcggctg attgcctcct gcgtaag1047
<210>2<211>324<212>PRT<213>Xanthomonas campestris pv.campestris<400>2Met Gln Arg Met Leu Arg Asp Met Leu Gln Pro Gln Asp Gln Pro Phe1 5 10 15Ser Asp Gly Gln Pro Pro Thr Asn Pro Asn Pro Thr Pro Pro Met Pro20 25 30Pro Ser Arg Pro Pro Cys Ser Thr Asn Pro Gly Gly Gln His Gly Ser35 40 45Gly Thr Gly Asp Gly Ser Gly Gly Asn Gly Gly Asn His Asn Arg Gly50 55 60Asn Gly Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Asp His Arg Ala Ser Pro Thr65 70 75 80Asn Pro Gly Gln Ala Val Arg Pro Cys Pro Asp Gly Pro Gln Ala Pro85 90 95Leu Pro Pro Gly Lys Val Val Thr Ala Pro Pro Gly Leu Gln Asn Lys100 105 110Thr Ile Val Val His Lys Gly Glu Val Phe Asp Gly Lys Gly Gln Thr115 120 125Tyr Ile Gly Gly Pro Gly Leu Gly Asp Gly Ser Gln Asn Glu His Gln130 135 140Gln Pro Leu Phe Val Val Glu Asp Gly Gly Ser Leu Cys Asn Val Asn145 150 155 160Met Lys Gly Gly Gly Asp Gly Val His Phe Met Gly Ser Gly Lys Met165 170 175Val Asn Cys Val Asn Asp Asp Val Ser Glu Asp Ala Val Thr Ile Asp180 185 190Gly Gln Gly Asn Arg Glu His Asp Ala Arg Ile Ala Gly Cys Arg Pro
195 200 205Glu Val Ser Gly Arg Pro Lys Val Asp Ile Ile Asn Cys Thr Phe Lys210 215 220Asn Ala Ala Asp Lys Val Val Gln Asp Asn Gly Ala Ala Asp Val Val225 230 235 240Met Ser Gly Cys Thr Val Asn Gly Ala Gly Lys Val Phe Arg Thr Asn245 250 255Gly Gly His Ala Asp Ile Asp Thr His Leu Gln Val Glu Asn Cys Asp260 265 270Phe Gln Gln Val Lys Glu Ala Val Phe Arg Thr Asp Ala Pro Gly Ala275 280 285Thr Val Lys Leu Ala Asn Leu Lys Thr Asp Ala Pro Asp Glu Val Ile290 295 300Ala Pro Ser Ala Phe Gln Ala Thr Gly Ala Thr Arg Ile Gly His Gln305 310 315 320Pro Tyr Ser Gly
权利要求
1.一种编码Harpin-like蛋白的基因，其是下列核苷酸序列之一1)SEQ ID No.1所示的DNA序列；2)与SEQ ID No.1所示DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于它具有SEQ ID No.1所示的DNA序列。
3.根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于自5’端的第57-1028位核苷酸为开放阅读框。
4.含有根据权利要求1或2所述的基因的表达载体。
5.根据权利要求4的表达载体，其为pET3023。
6.权利要求1或2所述的基因在植物病害防治中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中所述植物病害是由甘蓝黑腐病黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)所导致的甘蓝黑腐病。
8.权利要求1或2所述的基因作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述植物病害是由甘蓝黑腐病黄单胞菌所导致的甘蓝黑腐病。
全文摘要
本发明公开了来自甘蓝黑腐病黄单胞菌中的一个与致病相关的基因(Harpin蛋白基因)。本发明所提供的Harpin－like蛋白基因，其是下列核苷酸序列之一1)SEQ ID No.1所示的DNA序列；2)与SEQ ID No.1所示DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。本发明还涉及该基因在植物病害防治中的应用以及作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用。
文档编号C07K14/195GK1952148SQ20051008665
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月20日 优先权日2005年10月20日
发明者姜伯乐, 唐纪良, 何勇强, 唐东阶, 梁晓夏, 陆光涛, 徐荣旗, 李贤祯, 谭旖宁 申请人:广西大学