一种通用的有机磷农药无酶抑制电化学检测方法与流程

本发明属于电化学检测
技术领域：
，具体涉及一种适合不同类型有机磷农药残留检测的电化学方法。
背景技术：
：有机磷农药被广泛的用于农作物病虫害的防治。然而，过量以及不规范的使用将会引起环境污染以及人体中毒。有机磷农药作用于人的中枢神经系统，导致乙酰胆碱酯酶失活，一次次的农药中毒事件引起了社会的关注。因此，开发一种有效的有机磷农药检测技术来保证食品安全就显得尤为重要。传统的检测技术包括液相色谱法、气相色谱法、气质联用等，它们通常具有较高的精度和灵敏度，但缺点是仪器昂贵、样品预处理复杂以及需要专业的技术人员。相对而言，电化学检测技术是一种更加简便、快速和低成本的方法。有机磷农药的电化学检测主要分三类：直接氧化法、水解法、酶抑制法。其中，直接氧化法是最简便的，但是它只适用于小部分本身能发生氧化还原反应的有机磷农药。水解法是利用有机磷水解酶水解农药，通过检测水解产物来检测有机磷农药，该方法适用于大部分的有机磷农药，然而有机磷水解酶的合成复杂，目前市场上无法买到酶活力较高的有机磷水解酶。酶抑制法是目前有机磷农药电化学检测中运用最广泛的方法。有机磷农药对乙酰胆碱酯酶具有抑制作用，通过检测乙酰胆碱酯酶催化硫代乙酰胆碱水解产生的硫代胆碱来反应乙酰胆碱酯酶的被抑制程度，进而推算出有机磷农药的浓度。然而，酶的稳定性包括乙酰胆碱酯酶在内一直都是一个问题。除此之外，一些低毒的有机磷农药需要代谢活化之后才能抑制乙酰胆碱酯酶。根据发明人之前的研究结果，毒死蜱是一种含有“P＝S”键的有机磷农药，它需要被氧化成“P＝O”键来提高对乙酰胆碱酯酶的毒性，从而更有效的通过酶抑制法来对其进行检测，但是氧化农药及中和过量氧化剂的过程使得检测步骤更加繁琐。技术实现要素：本发明的目的是针对现存有机磷农药电化学检测方法的不足，提供一种全新的通用的有机磷农药电化学检测方法，该方法具有简便、快速、稳定、低成本、广谱等优点。为此，本发明采用以下技术方案：一种通用的有机磷农药无酶抑制电化学检测方法，其特征在于，它采用以氯解磷定溶液作为探针的，对于待测有机磷农药的峰电流强度抑制率-有机磷农药浓度标准曲线；并包括以下步骤：(1)待测样品预处理：取待测农产品样本，加入缓冲溶液中，浸泡，取上清液待测；(2)待测样品有机磷农药残留检测：取步骤(1)上清液，加入氯解磷定溶液作为探针，使用电化学方法测量其氧化峰电流，根据同浓度探针溶液在无待测样品的缓冲液中的氧化峰电流大小，计算其峰电流强度抑制率，根据所述标准曲线得出溶液中有机磷农药浓度，计算农产品中有机磷农药残留量。进一步地，所述标准曲线采用以下方法绘制：在缓冲溶液中，加入氯解磷定溶液作为探针，使用电化学方法测量其氧化峰电流，再向其中加入已知浓度的有机磷农药，使用同种电化学方法测量此时的氧化峰电流，计算峰电流强度抑制率；使用不同浓度有机磷农药，重复上述步骤；绘制峰电流强度抑制率-有机磷农药浓度标准曲线。所述步骤(2)待测样品有机磷农药残留检测所用的电化学测量方法与绘制标准曲线所使用的方电化学测量法相同。进一步地，进行所述电化学方法测量的电化学工作站包含电化学检测仪器以及三电极系统。电化学检测仪器可以如CHI440C，CHI660E，CHI760E电化学检测仪等。三电极系统中包括工作电极，如玻碳电极、各类修饰电极等；参比电极，如Ag/AgCl电极等；对电极，如铂电极等。进一步地，所述缓冲溶液选择范围包括磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、Tris缓冲液等。进一步地，所述缓冲溶液pH优选为7.0。进一步地，所述氯解磷定在检测体系中的浓度可根据待测有机磷农药浓度调节如25μM、50μM、100μM等。另外，并非所有解磷定均能作为电化学探针，如碘解磷定，其中碘离子会在邻近特征峰附近产生明显信号峰，干扰检测。进一步地，所述电化学方法的选择范围包扩差分脉冲伏安法、方波伏安法等。进一步地，所述的峰电流强度抑制率计算方法为：峰电流强度抑制率＝(氯解磷定初始峰电流强度-加入有机磷农药后峰电流强度)÷氯解磷定初始峰电流强度×100％。进一步地，所述叶菜类农产品质量与缓冲液比例为1g：10mL，非叶菜类农产品质量与缓冲液比例为2g：10mL。本发明的有益效果：本发明检测方法具有简便、快速、稳定、低成本、广谱等优点。作为电化学检测方法相较于传统方法，其本身具有简便、快速、低成本等优点。所述氯解磷定为有机磷农药解毒剂，其分子结构中含有季铵基团，既能与游离的有机磷农药结合，成为无毒的化合物排出体外；也能在一定程度上恢复胆碱酯酶的活性。相较于现存三类有机磷农药电化学检测方法，本发明中使用的氯解磷定相较于乙酰胆碱酯酶和有机磷水解酶更易保存，更稳定，且可从医院、制药厂、化学试剂公司获得，相比于乙酰胆碱酯酶成本更低，相比于合成复杂尚且没有商品化的有机磷水解酶，氯解磷定更易获得。并且，氯解磷定能与大部分有机磷农药发生反应，其适用范围超过那些本身可以发生氧化还原反应的有机磷农药和能对乙酰胆碱酯酶具有强烈抑制作用的有机磷农药。因此，本发明中的有机磷农药电化学检测方法具有更加广谱的使用范围。附图说明图1为采用实施例1中所述方法绘制的毒死蜱检测标准曲线(a：0μM，b:0.025μM，c:0.28μM，d:0.79μM，e:3.33μM，f:13.5μM，g:空白对照)。图2为采用实施例1中所述方法绘制毒死蜱标准曲线的拟合线。图3为采用实施例2中所述方法绘制的倍硫磷检测标准曲线(a：0μM，b:0.18μM，c:0.45μM，d:1.17μM，e:8.35μM，f:15.5μM，g:空白对照)。图4为采用实施例2中所述方法绘制倍硫磷标准曲线的拟合线。图5为采用实施例3中所述方法绘制的甲基对硫磷检测标准曲线(a：0μM，b:0.38μM，c:2.28μM，d:6.08μM，e:11.78μM，f:19.37μM，g:空白对照)。图6为采用实施例3中所述方法绘制甲基对硫磷标准曲线的拟合线。具体实施方式为了更好的说明本发明，下面通过实施例予以进一步说明。以下实施例中：(1)氯解磷定溶液配制：氯解磷定可选用粉末药品，溶于去离子水。也可选择氯解磷定注射剂，用去离子水稀释到所需浓度。以下实施例中选择的检测液中氯解磷定浓度为100μM。(2)缓冲液配制：磷酸缓冲液，可选用纳盐或钾盐，用去离子水配制pH7.0缓冲溶液。以下实施例选用缓冲浓度为0.1M。(3)农药配制：可选用粉末药品或标准溶液，用有机溶剂如丙酮、乙醇、甲醇等稀释到所需浓度。(4)电化学工作站搭建：以下实施例中选用CHI440C电化学检测仪，以玻碳电极作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，以铂电极作为对电极。(5)电化学检测参数设定：以下实施例均采用差分脉冲伏安法，电位范围：0.5～1V，电位增量：0.004V，振幅：0.05V，脉冲宽度：0.05s，采样宽度：0.0167s，脉冲周期：0.2s。(6)绘制标准曲线：以下实施例，在pH7.0磷酸缓冲溶液中，以100μM氯解磷定溶液作为探针，使用差分脉冲伏安法测其氧化峰电流，再向其中加入已知浓度的有机磷农药，测量此时的氧化峰电流，计算峰电流强度抑制率。使用一系列已知的不同浓度的有机磷农药，重复上述步骤。绘制氧化峰电流强度抑制率-有机磷农药浓度标准曲线。(7)农产品有机磷残留检测：以下实施例，取3g叶菜或6g非叶菜农产品，切块，加入30mL磷酸缓冲液，浸泡2min，静置。取上清液，加入100μM氯解磷定溶液作为探针，使用脉冲伏安法测其氧化峰电流，根据标准曲线得出溶液中有机磷农药浓度，计算农产品中有机磷农药残留量。(8)加标回收率试验：在(7)的基础上，加入已知浓度和种类的有机磷农药，进行加标回收率试验验证本发明可行性。实施例1毒死蜱检测标准曲线绘制：步骤如上(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)所述。其中，磷酸缓冲液配制选择二水合磷酸二氢钠与十二水合磷酸氢二钠；毒死蜱粉末用乙醇溶解，检测体系中的毒死蜱浓度梯度为0.025,0.28,0.79,3.33,13.5μM。绘制峰电流强度抑制率-有机磷农药浓度标准曲线，见图1；根据标准曲线绘制拟合线，见图2。实施例2倍硫磷检测标准曲线绘制：步骤如上(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)所述。其中，磷酸缓冲液配制选择二水合磷酸二氢钠与十二水合磷酸氢二钠；倍硫磷为甲醇基体的标准溶液，取不同体积加入检测体系，倍硫磷浓度梯度为0.18,0.45,1.17,8.35,15.5μM。绘制峰电流强度抑制率-有机磷农药浓度标准曲线，见图3；根据标准曲线绘制拟合线，见图4。实施例3甲基对硫磷检测标准曲线绘制：步骤如上(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)所述。其中，磷酸缓冲液配制选择二水合磷酸二氢钠与十二水合磷酸氢二钠；甲基对硫磷为甲醇基体的标准溶液，取不同体积加入检测体系，甲基对硫磷浓度梯度为0.38,2.28,6.08,11.78,19.37μM。绘制峰电流强度抑制率-有机磷农药浓度标准曲线，见图5；根据标准曲线绘制拟合线，见图6。实施例4加标回收率试验：(1)3g大白菜，加入30mL磷酸缓冲液，浸泡2min，取浸出液测量得到抑制率1，根据抑制率计算得有机磷农药浓度1，再向其中加入1.02μM毒死蜱，得抑制率2，计算得总浓度2，回收率根据公式：回收率＝(浓度2-浓度1)÷加标量×100％计算加标回收率。(2)3g小青菜，加入30mL磷酸缓冲液，浸泡2min，取浸出液测量得到抑制率1，根据抑制率计算得有机磷农药浓度1，再向其中加入3.59μM倍硫磷，得抑制率2，计算得总浓度2，根据回收率公式计算加标回收率。(3)6g玉米，加入30mL磷酸缓冲液，浸泡2min，取浸出液测量得到抑制率1，根据抑制率计算得有机磷农药浓度1，再向其中加入5.70μM甲基对硫磷，得抑制率2，计算得总浓度2，根据回收率公式计算加标回收率。以上实验结果见表1：样本农药残留加标农药加标量(μM)回收率(％)大白菜未检出毒死蜱1.0298.9±4.0小青菜未检出倍硫磷3.59101.2±2.0玉米未检出甲基对硫磷5.70105.0±0.8当前第1页1 2 3