一种重金属离子电化学传感器的制备方法及应用与流程

本发明属于分析化学或环境监测技术领域，涉及一种基于生物条形码和银染双重信号放大技术联用构建的重金属离子Ag⁺的电化学传感器的制备方法及对水体样品中重金属离子的检测方法。具体的是利用生物条形码结合银染信号放大技术和电化学分析检测技术对水体中的重金属离子Ag⁺进行灵敏检测。

背景技术：

银已经被广泛应用于生产硬币、珠宝、餐具、合金、电气设备、反射镜和用于摄影的化学品中。银离子（Ag⁺）同时也是一种危险的重金属离子，它能通过食物链或者饮用水进入人体，对细胞具有毒性，伴随着银中毒，肠胃炎、神经紊乱、精神疲劳、风湿、软骨打结、成纤维细胞等对人体健康造成危害。因此，发展快速测定微量Ag⁺的方法十分重要。

研究表明，金属离子能选择性的结合到天然或人工的DNA碱基上，形成以金属介导的碱基对，通过寡核苷酸结构的变化来检测金属离子。类似地，Ag⁺能特异性识别胞嘧啶（C）-胞嘧啶（C）错配，形成稳定的C-Ag⁺-C 结构，这促使了Ag⁺传感检测方法的快速发展。

纳米粒子在纳米技术和纳米科学的发展中具有重要的推动作用，相比传统材料，其具有独特的性质。金纳米粒子（AuNPs）在纳米粒子中广受传感器研究者的青睐，特别是近些年在DNA传感器的研究开发中。巯基修饰的DNA可以与AuNPs通过Au-S共价键连接，实现AuNPs与生物活性分子的结合。目前，AuNPs-DNA探针已被应用于蛋白质、小分子和金属离子的检测。银增强作为一种信号放大技术常常用于免疫传感研究，同时也能提高检测灵敏度。该技术中，AuNPs本身能够催化还原Ag⁺，Ag⁺在温和的还原剂（如对苯二酚）作用下能够还原为银单质，沉积在AuNPs表面，形成银层。同时，在银层的催化下，更多的Ag⁺被还原，导致AuNPs表面的银层生长成银壳，显著增大了检测信号。

电化学检测技术是近年来发展较快的一种分析方法，电化学法的检测限较低，灵敏度较高，操作简便，检测速度快，是一种基本上对环境无污染的绿色技术，受到了国内外研究者的广泛重视。纳米材料结合生物条形码和银染信号放大技术所构建的电化学传感器在重金属污染物检测方面具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种基于生物条形码和银染双重信号放大技术联用检测重金属离子的方法。

本发明的目的之二是提供一种基于生物条形码和银染双重信号放大技术联用构建的重金属电化学传感器的制备方法。

本发明的目的之三是将所制得的电化学传感器用于Ag⁺的高灵敏、快速检测。

本发明的技术方案，包括以下步骤：

一种基于生物条形码和银染双重信号放大技术联用检测重金属Ag⁺离子的方法

(1) 寡核苷酸序列设计

本发明所设计的寡核苷酸序列如下：

底物链（sub-DNA）：5’-CCT CCA ACC TCT-SH-(C₆)-3’

生物条形码链（bioDNA）：5’-SH-(C₆)-ACA CCT TCC ACC-3’

将寡核苷酸溶解在10 mM pH 7.4的磷酸缓冲溶液中，-18℃保存备用；

(2) bioDNA-AuNPs的制备

采用柠檬酸还原法制备AuNPs。将1 mL 1%的HAuCl₄溶液稀释至100 mL，搅拌下加热回流，加入3 mL 1%的柠檬酸三钠溶液，继续回流至溶液颜色由淡黄变为酒红色。室温下搅拌冷却，得到AuNPs溶液。将AuNPs与1 mM活化的bioDNA在4 °C下反应12 h，加入10 mM PBS (pH 7.4, 20 mM NaCl)孵化4 h，12000 rpm下离心5 min，将沉淀重新分散在10 mM PBS (pH 7.4, 50 mM NaCl)中，得到bioDNA-AuNPs，4 ℃保存备用；

(3) 银增强溶液的制备

配制1.5 mM的AgNO₃溶液（A）、52 mM的对苯二酚溶液（B）、120 mM柠檬酸和80 mM柠檬酸钠溶液（C），将A、B和C三种溶液等体积混合，得到银增强溶液；

(4) 生物条形码和银染双重信号放大技术联用

利用自组装方法，将富含C碱基的底物链（sub-DNA）通过Au-S键固定在金电极表面。一定条件下，溶液中Ag⁺与AuNPs上标记的富含C碱基的生物条形码链（bioDNA）选择性的结合，形成稳定的C-Ag⁺-C络合物，Ag⁺和AuNPs接近电极表面，电子传递能力增强。当Ag⁺通过dsDNA结构吸附到DNA骨架上，以对苯二酚作为还原剂，Ag⁺被还原为银纳米颗粒，聚集在纳米金表面及电极表面，电化学检测信号二次放大。位于Ag⁺-DNA中的银纳米颗粒以及金核银壳（Au@Ag）纳米复合物成为了电化学信号放大器。

一种基于生物条形码和银染双重信号放大技术联用构建的重金属Ag⁺离子电化学传感器的制备方法，将工作电极金电极在piranha溶液中浸泡1 h，超纯水清洗。然后分别用0.3 um和0.05 um的Al₂O₃抛光粉打磨，依次在超纯水、无水乙醇、超纯水中超声清洗。最后在0.5 M H₂SO₄溶液中，以50 mV/s的扫速在-0.2~1.6 V之间进行循环伏安扫描30圈，活化电极。N₂气吹干备用；滴加10 mL 0.1 mM的sub-DNA 固定缓冲溶液在处理好的金电极表面，30 °C恒温水浴16 h，缓冲液清洗，制得sub-DNA/Au电极。将sub-DNA/Au电极浸入50 mM MCH溶液中5 min，缓冲液清洗，制得MCH/sub-DNA/Au电极。将MCH/sub-DNA/Au电极浸入bioDNA-AuNPs和Ag⁺离子的缓冲液中，45 °C恒温杂交反应3 h，杂交缓冲液和超纯水清洗，暗处室温条件下浸入银增强溶液中3 min，超纯水清洗，制得Ag enhancer/dsDNA/MCH/Au重金属离子电化学传感器。

重金属离子的检测

(1) 重金属离子电化学检测

使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，金电极或Ag enhancer/dsDNA/MCH/Au为工作电极。为了检测Ag⁺离子，在Ag enhancer/dsDNA/MCH/Au传感器制备过程中，将MCH/sub-DNA/Au电极浸入bioDNA-AuNPs和不同浓度的Ag⁺离子缓冲液中，恒温杂交，银增强溶液处理；

(2) 电化学检测技术

电化学检测技术采用循环伏安法（CV），以0.1 M KClO₄为缓冲液，电位范围为0~0.6 V，扫描速率为0.1 V/s；或微分脉冲伏安法（DPV），以0.1 M KClO₄为缓冲液，电位范围为0~0.5 V，电位增幅为4 mV，脉冲周期为0.5 s；

(3) 选择性检测

根据微分脉冲伏安法（DPV）的电流信号强度与Ag⁺离子浓度之间的线性关系，绘制工作曲线；

(4) 样品测定

采用标准加入法，在样品溶液中加入不同浓度的Ag⁺离子标准溶液，按照工作曲线的绘制方法对不同浓度的Ag⁺离子进行检测；

与现有技术相比，本发明具有以下有益成果：

1. 本发明利用生物条形码和银染双重信号放大技术联用检测重金属Ag⁺离子；

2. 本发明将生物条形码和银染双重信号放大技术联用应用于电化学传感器上检测重金属离子，对Ag⁺离子有很高的响应灵敏度，检出限为3 pM；

3. 本发明提供的修饰电极制备简单，测定灵敏度高，线性范围宽，抗干扰能力强，可实现对实际水样中超痕量重金属离子的快速、准确和灵敏测定。

附图说明

图1是本发明制得的金纳米粒子的透射电镜图；

图2是bioDNA (a)、AuNPs (b)和bioDNA-AuNPs (c)的紫外-可见光谱图；

图3是本发明基于生物条形码和银染双重信号放大技术构建Ag⁺电化学传感器的设计原理和检测原理示意图；

图4是本发明制得的dsDNA/MCH/Au电极经不同银染时间(a-0, b-3, c-5, d-10 min)的紫外-可见光谱图；

图5是本发明制得的裸Au电极(a)、sub-DNA/Au电极(b)、MCH/sub-DNA/Au电极(c)、dsDNA/MCH/Au电极(d)、银增强3分钟/dsDNA/MCH/Au电极(e)和银增强10分钟/dsDNA/MCH/Au电极(f)的电化学阻抗谱图；

图6是本发明制得的dsDNA/MCH/Au电极经银染前(a)和银染后(b)的循环伏安曲线(A)和微分脉冲曲线的(B)对比图；

图7是本发明制得的Ag enhancer/dsDNA/MCH/Au电极对0 M (a)和2.5 nM (b) Ag⁺的循环伏安曲线(A)和微分脉冲曲线(B)对比图；

图8是本发明制得的Ag enhancer/dsDNA/MCH/Au电极在0.1 M KClO₄溶液中对2.5 nM Ag⁺在(A)低扫描速度(20, 40, 60, 80, 100 mV/s)和(B)高扫描速率(120, 160, 200, 250, 300, 400, 500 mV/s)下的循环伏安曲线图；

图9是本发明制得的Ag enhancer/dsDNA/MCH/Au电极对不同浓度Ag⁺的微分脉冲曲线(A)和工作曲线(B)图；

图10是本发明制得的Ag enhancer/dsDNA/MCH/Au电极对不同金属离子(A)和金属离子标准溶液(B)微分脉冲曲线响应电流的对比图。

具体实施方式

结合附图，对本发明的优选实施例详述如下：

实施例1 一种基于生物条形码和银染双重信号放大技术联用检测重金属Ag⁺离子的方法

(1) 寡核苷酸序列设计

本发明所设计的寡核苷酸序列由中国上海Sangon生物工程有限公司合成，并通过 HPLC纯化检验，冻干。本发明设计的寡核苷酸序列如下：

底物链（sub-DNA）：5¢-CCT CCA ACC TCT-SH-(C₆)-3¢

生物条形码链（bioDNA）：5¢-SH-(C₆)-ACA CCT TCC ACC-3¢

将寡核苷酸溶解在10 mM pH 7.4的磷酸缓冲溶液中，-18 °C保存备用；

(2) bioDNA-AuNPs的制备

采用柠檬酸还原法制备AuNPs。将1 mL 1%的HAuCl₄溶液稀释至100 mL，搅拌下加热回流，加入3 mL 1%的柠檬酸三钠溶液，继续回流至溶液颜色由淡黄变为酒红色。室温下搅拌冷却，得到AuNPs溶液。图1是本发明制得的金纳米粒子的透射电镜图，从图中可以看出制备的AuNPs为球形，平均半径为16±2 nm。进一步元素分析测定结果表明，制得的AuNPs仅含Au元素；

将AuNPs与1 mM活化的bioDNA在4 °C下反应12 h，加入10 mM PBS (pH 7.4, 20 mM NaCl)孵化4 h，12000 rpm下离心5 min，将沉淀重新分散在10 mM PBS (pH 7.4, 50 mM NaCl)中，得到bioDNA-AuNPs，4 °C保存备用。图2是bioDNA (a)、AuNPs (b)和bioDNA-AuNPs (c)的紫外-可见光谱图，从图中可以看出bioDNA已经成功标记在AuNPs上，即金纳米粒子探针bioDNA-AuNPs成功制备；

(3) 银增强溶液的制备

配制1.5 mM的AgNO₃溶液（A）、52 mM的对苯二酚溶液（B）、120 mM柠檬酸和80 mM柠檬酸钠溶液（C），将A、B和C三种溶液等体积混合，得到银增强溶液；

(4) 生物条形码和银染双重信号放大联用技术

图3是本发明设计的基于生物条形码和银染双重信号放大技术联用构建Ag⁺电化学传感器的设计原理示意图。首先利用自组装方法，将富含C碱基的底物链（sub-DNA）通过Au-S键固定在金电极表面。一定条件下，溶液中Ag⁺与AuNPs上标记的富含C碱基的生物条形码链（bioDNA）选择性的结合，形成稳定的C-Ag⁺-C络合物，Ag⁺和AuNPs接近电极表面，电子传递能力增强。当Ag⁺通过dsDNA结构吸附到DNA骨架上，以对苯二酚作为还原剂，Ag⁺被还原为银纳米颗粒，聚集在纳米金表面及电极表面，电化学检测信号二次放大。位于Ag⁺-DNA中的银纳米颗粒以及金核银壳（Au@Ag）纳米复合物成为了电化学信号放大器。

；实施例2 一种基于生物条形码和银染双重信号放大技术联用构建的重金属Ag⁺离子电化学传感器的制备方法

图3也是本发明基于生物条形码和银染双重信号放大技术构建Ag⁺电化学传感器的制备过程示意图。首先将工作电极金电极在piranha溶液中浸泡1 h，超纯水清洗。然后分别用0.3 mm和0.05 mm的Al₂O₃抛光粉打磨，依次在超纯水、无水乙醇、超纯水中超声清洗。最后在0.5 M H₂SO₄溶液中，以50 mV/s的扫速在-0.2~1.6 V之间进行循环伏安扫描30圈，活化电极。N₂气吹干备用；

滴加10 mL 0.1 mM的sub-DNA 固定缓冲溶液在处理好的金电极表面，30 °C恒温水浴16 h，缓冲液清洗，制得sub-DNA/Au电极。将sub-DNA/Au电极浸入50 mM MCH溶液中5 min，缓冲液清洗，制得MCH/sub-DNA/Au电极。将MCH/sub-DNA/Au电极浸入bioDNA-AuNPs和Ag⁺离子的缓冲液中，45 °C恒温杂交反应3 h，用杂交缓冲液和超纯水清洗，在暗处室温条件下浸入银增强溶液中3 min，再用超纯水清洗，制得Ag enhancer/dsDNA/MCH/Au重金属离子电化学传感器；

图4是本发明制得的dsDNA/MCH/Au电极经不同银染时间(a-0, b-3, c-5, d-10 min)的紫外-可见光谱图，由图可见，随着银染时间的增加，银粒子的特征吸收峰越来越强，表明Ag⁺被还原为银纳米粒子包裹在AuNPs表面，通过调整银染时间可以控制银粒子的尺寸；

图5是本发明制得的裸Au电极(a)、sub-DNA/Au电极(b)、MCH/sub-DNA/Au电极(c)、dsDNA/MCH/Au电极(d)、银染3分钟/dsDNA/MCH/Au电极(e)和银染10分钟/dsDNA/MCH/Au电极(f)的电化学阻抗谱图，从图中可以得到不同组分被依次成功地组装到电极表面，改变了修饰电极界面的电子传递能力；

图6是本发明制得的dsDNA/MCH/Au电极经银染前(a)和银染后(b)的循环伏安曲线(A)和微分脉冲曲线的(B)对比图，从图中可以得到生物条形码结合银染技术能够实现Ag⁺检测信号的显著放大。

重金属离子的检测

(1) 重金属离子电化学检测

使用上海辰华电化学工作站对三电极体系进行测试，以饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，金电极或Ag enhancer/dsDNA/MCH/Au为工作电极。为了检测Ag⁺离子，在Ag enhancer/dsDNA/MCH/Au传感器制备过程中，将MCH/sub-DNA/Au电极浸入bioDNA-AuNPs和不同浓度的Ag⁺离子缓冲液中，恒温杂交，银增强溶液处理；

(2) 电化学检测技术

电化学检测技术采用循环伏安法（CV），以0.1 M KClO₄为缓冲液，电位范围为0~0.6 V，扫描速率为0.1 V/s；或微分脉冲伏安法（DPV），以0.1 M KClO₄为缓冲液，电位范围为0~0.5 V，电位增幅为4 mV，脉冲周期为0.5 s；

图7是本发明制得的Ag enhancer/dsDNA/MCH/Au电极对0 M (a)和2.5 nM (b) Ag⁺的循环伏安曲线(A)和微分脉冲曲线(B)对比图，从图中可以得到在Ag⁺的存在下，sub-DNA 能与 bioDNA-AuNPs探针通过 C-Ag⁺-C 形式进行特异性杂交，导致电化学信号显著增大。并且通过对比循环伏安曲线和微分脉冲曲线，可以看出本发明制得的电化学传感器采用微分脉冲法对Ag⁺的响应灵敏度更高；

图8是本发明制得的Ag enhancer/dsDNA/MCH/Au电极在0.1 M KClO₄溶液中对2.5 nM Ag⁺在(A)低扫描速率(20, 40, 60, 80, 100 mV/s)和(B)高扫描速率(120, 160, 200, 250, 300, 400, 500 mV/s)下的循环伏安曲线图，从图中可以得到，在低扫描速率下，峰电流与扫描速率成线性关系，表明电极反应此时是受扩散控制的过程；在高扫描速率下，峰电流与扫描速率的平方根成线性关系，表明电极反应此时是受吸附控制的过程；

(3) 选择性检测

在最优实验条件下检测一系列标准浓度Ag⁺溶液的微分脉冲曲线，得到峰电流与浓度的关系曲线。结果如图9所示，在5 pM至50 mM浓度范围内，两者呈现良好的线性关系，相关系数R为0.9989，线性方程为i_pc (mA) = –7.9842 lgc (mM) - 43.322，检出限为3 pM。本发明提出的传感器相比较其他传感器，具有宽的线性范围和低的检出限，采用金标银染双重信号放大技术可实现Ag⁺的超痕量检测；

图10是本发明制得的Ag enhancer/dsDNA/MCH/Au电极对不同金属离子(A)和金属离子标准溶液(B)微分脉冲曲线响应电流的对比图，从图中可以得到当其它金属离子与Ag⁺共存时，不干扰Ag⁺的测定；

(4) 样品测定

将待测样品溶液代替重金属离子Ag⁺标准溶液，按照工作曲线的绘制方法对样品溶液中的Ag⁺进行测定。测定结果表明，检测结果与加入的Ag⁺标准溶液浓度一致，具有满意的回收率和相对标准偏差，本发明制备的电极能用于实际样品中Ag⁺的测定。

上面结合附图对本发明实施例进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明基于生物条形码和银染双重信号放大技术联用构建重金属离子电化学传感器的制备方法，超痕量重金属离子电化学测定方法及应用的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。