本发明涉及一种贵金属纳米材料电化学免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用CeO2-CuO-NH2-Au NPs作为基底材料，Au@Ag异质结纳米棒和硫堇作为二抗标记物，构建了夹心型免疫传感器并实现了对玉米赤霉烯酮的特异性检测，属于新型生物传感技术的发展和新型传感方法构建技术领域。
背景技术：
玉米赤霉烯酮作为一种真菌毒素又名F-2毒素，主要在有赤霉病的玉米中分离得到。玉米赤霉烯酮能污染玉米、小麦、小米等农作物，同时由于它具有雌激素作用，还会影响动物的繁殖技能甚至会导致动物死亡。传统的检测一般都采用液相色谱、气相色谱、质谱和毛细管电泳法等方法，但是这些方法大都存在一定的局限性，如对所需仪器设备要求过高、样品前处理比较复杂等，而电化学传感器具有操作简便、成本低等优点，备受人们的关注。
本发明基于纳米功能材料构建了一种新型的夹心型电化学免疫传感器，用于玉米赤霉烯酮的检测。利用CeO2-CuO-NH2-Au NPs作为基底材料，Au@Ag异质结纳米棒和硫堇作为二抗标记物构建了夹心型免疫传感器，实现了对玉米赤霉烯酮的检测。测试结果显示，上述方法制备的电化学免疫传感器检测灵敏度高、选择性好、重现性好、稳定性高并且易于小型化，一定程度上解决了仪器设备成本问题，基于上述发现，发明人完成了本发明。
技术实现要素：
本发明的目的之一是基于CeO2-CuO-NH2-Au NPs为基底材料，利用Au@Ag异质结纳米棒和硫堇为标记层，构建了一种夹心型的快速超灵敏的电化学免疫传感器。
本发明的目的之二是提供一种基于Au@Ag异质结纳米棒的电化学免疫传感器的制备方法，该方法制备的传感器具有稳定性和选择性好以及灵敏度高的特点。
本发明的目的之三是实现了所述电化学免疫传感器的构建并且对玉米赤霉烯酮进行了有效的检测，实现了所述电化学免疫传感器测定玉米赤霉烯酮的作用。
本发明的技术方案如下：
1. 一种基于Au@Ag异质结纳米棒的玉米赤霉烯酮免疫传感器的构建
（1）用Al2O3抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极，超纯水清洗干净；将6 µL 1.0~1.6 mg/mL Au纳米颗粒杂化氨基化CeO2-CuO纳米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs分散液滴加到电极表面，室温下晾干成膜；
（2）依次滴加6 µL 1~5 µg/mL的玉米赤霉烯酮抗体anti-ZEN，3 µL 质量分数为0.5% ~ 2%的BSA溶液到电极表面，超纯水洗净，室温下晾干；
（3）滴加6 µL 10-4~100 ng/mL的一系列不同浓度的玉米赤霉烯酮到电极表面，孵化2 h，超纯水冲洗，室温下晾干；
（4）滴加6 µL Au@Ag异质结纳米棒负载硫堇Th的二抗标记物Au@Ag@Ab2@Th，超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种夹心型免疫传感器。
2. Au纳米颗粒杂化氨基化CeO2-CuO纳米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs分散液的制备
（1）CeO2纳米棒的制备
将10~200 mg CeCl3·7H2O在磁力搅拌下溶解于1~50 mL无水乙醇中并加入1.3 mL 0.75 mol/L的H2SO4，将得到的白色悬浮液转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，于10~200 °C下加热1~50 h，将产物离心分离后加入到饱和氢氧化钠醇溶液中静置1~10天，将产物洗涤干燥即得到CeO2纳米棒；
（2）CeO2-CuO纳米棒的制备
将1~10 mg Cu(CH3COO)2·H2O溶解到16 mL乙醇中，然后将1~100 mg CeO2纳米棒加入上述溶液中并在1~200 °C条件下反应12 h，将产物离心分离并在80 °C下干燥1~10 h制得CeO2-CuO纳米棒；
（3）Au纳米颗粒杂化氨基化CeO2-CuO纳米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs的制备
将制得的CeO2-CuO纳米棒加入到50 mL无水乙醇中，并加入1 mL三氨丙基三乙氧基硅烷70 °C下加热2 h，通过离心分离得到氨基化CeO2-CuO，将氨基化CeO2-CuO加入Au NPs洗涤干燥即得Au纳米颗粒杂化氨基化CeO2-CuO纳米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs。
3. Au@Ag异质结纳米棒负载硫堇的二抗标记物Au@Ag@Ab2@Th的制备
（1）Au@Ag异质结结纳米棒的制备
将1~200 mg硝酸银、0.6 mL 20 mg/mL氯金酸及0.5640 g PDDA同时加入到140 mL乙二醇溶液中，在195 °C条件下反应80 h，将产物离心分离并用超纯水洗涤即得Au@Ag异质结纳米棒；
（2）Au@Ag异质结纳米棒负载硫堇的二抗标记物Au@Ag@Ab2@Th的制备
将0.5 mL 1.0 mg/mL Au@Ag 异质结纳米棒样品溶于1.0 mL超纯水中，并加入0.1 mL的玉米赤霉烯酮抗体anti-ZEN和硫堇，4 °C下振荡1~5 h，得到的产物14500 rpm离心分离，固体重新分散在蒸馏水中即为Au@Ag异质结纳米棒负载硫堇的二抗标记物Au@Ag@Ab2@Th。
4. 玉米赤霉烯酮的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL的含有浓度为4~6 mmol/L铁氰化钾和10-2~10 mmol/L硝酸钾溶液中进行测试；
（2）用方波伏安法对玉米赤霉烯酮标准溶液进行检测，其电压测试范围为0V ~ 0.6V；
（3）当背景电流趋于稳定后，通过记录玉米赤霉烯酮加入前后的传感器的峰电流值的变化，绘制工作曲线。
本发明的有益成果
（1）本发明的发明人首次将Au@Ag异质结纳米棒作为二抗标记物应用到电化学免疫传感器的制备当中，Au@Ag异质结纳米棒能够很好的连接玉米赤霉烯酮抗体，同时具有很强的电子传递能力，使电化学免疫传感器的灵敏度得以提高。
（2）在本发明的制备方法中，将氨基化的CeO2-CuO与金纳米颗粒的复合物CeO2-CuO-NH2-Au NPs作为基底材料，能够加速电极表面的电子传递，并且Au易于牢固的和抗体连接，提高了传感器的稳定性。
（3）本发明采用硫堇作为电子媒介体，构建了一个夹心型电化学免疫传感器，并且对玉米赤霉烯酮进行了有效的检测，此方法操作简单，耗时短且降低了成本。
（4）本发明制备的电化学免疫传感器用于玉米赤霉烯酮的检测，该电化学传感器稳定性高，重现性好，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。
具体实施方式
实施例1 一种基于Au@Ag异质结纳米棒的玉米赤霉烯酮免疫传感器的构建
（1）用Al2O3抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极，超纯水清洗干净；将6 µL1.0 mg/mL Au纳米颗粒杂化氨基化CeO2-CuO纳米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs分散液滴加到电极表面，室温下晾干成膜；
（2）依次滴加6 µL 1 µg/mL的玉米赤霉烯酮抗体anti-ZEN，3 µL 质量分数为0.5%的BSA溶液到电极表面，超纯水洗净，室温下晾干；
（3）滴加6 µL 10-4~100 ng/mL的一系列不同浓度的玉米赤霉烯酮到电极表面，孵化2 h，超纯水冲洗，室温下晾干；
（4）滴加6 µL Au@Ag异质结纳米棒负载硫堇的二抗标记物Au@Ag@Ab2@Th，超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种夹心型免疫传感器。
实施例2 一种基于Au@Ag异质结纳米棒的玉米赤霉烯酮免疫传感器的构建
（1）用Al2O3抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极，超纯水清洗干净；将6 µL 1.2 mg/mL Au纳米颗粒杂化氨基化CeO2-CuO纳米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs分散液滴加到电极表面，室温下晾干成膜；
（2）依次滴加6 µL 3.5 µg/mL的玉米赤霉烯酮抗体anti-ZEN，3 µL 质量分数为1%的BSA溶液到电极表面，超纯水洗净，室温下晾干；
（3）滴加6 µL 10-4~100 ng/mL的一系列不同浓度的玉米赤霉烯酮到电极表面，孵化2 h，超纯水冲洗，室温下晾干；
（4）滴加6 µL Au@Ag异质结纳米棒负载硫堇的二抗标记物Au@Ag@Ab2@Th，超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种夹心型免疫传感器。
实施例3 一种基于Au@Ag异质结纳米棒的玉米赤霉烯酮免疫传感器的构建
（1）用Al2O3抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极，超纯水清洗干净；将6 µL1.6 mg/mL Au纳米颗粒杂化氨基化CeO2-CuO纳米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs分散液滴加到电极表面，室温下晾干成膜；
（2）依次滴加6 µL 5 µg/mL的玉米赤霉烯酮抗体anti-ZEN，3 µL 质量分数为2%的BSA溶液到电极表面，超纯水洗净，室温下晾干；
（3）滴加6 µL 10-4~100 ng/mL的一系列不同浓度的玉米赤霉烯酮到电极表面，孵化2 h，超纯水冲洗，室温下晾干；
（4）滴加6 µL Au@Ag异质结纳米棒负载硫堇的二抗标记物Au@Ag@Ab2@Th，超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种夹心型免疫传感器。
实施例4 Au纳米颗粒杂化氨基化CeO2-CuO纳米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs分散液的制备
（1）CeO2纳米棒的制备
将10 mg CeCl3·7H2O在磁力搅拌下溶解于1 mL无水乙醇中并加入1.3 mL 0.75 mol/L的H2SO4，将得到的白色悬浮液转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，于10 °C下加热1 h，将产物离心分离后加入到饱和氢氧化钠醇溶液中静置1天，将产物洗涤干燥即得到CeO2纳米棒；
（2）CeO2-CuO纳米棒的制备
将1 mg Cu(CH3COO)2·H2O溶解到16 mL乙醇中，然后将1 mg CeO2纳米棒加入上述溶液中并在1 °C条件下反应12 h，将产物离心分离并在80 °C下干燥1 h制得CeO2-CuO纳米棒；
（3）Au纳米颗粒杂化氨基化CeO2-CuO纳米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs的制备
将制得的CeO2-CuO纳米棒加入到50 mL无水乙醇中，并加入1 mL三氨丙基三乙氧基硅烷70 °C下加热2 h，通过离心分离得到氨基化CeO2-CuO，将氨基化CeO2-CuO加入Au NPs洗涤干燥即得Au纳米颗粒杂化氨基化CeO2-CuO纳米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs。
实施例5 Au纳米颗粒杂化氨基化CeO2-CuO纳米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs分散液的制备
（1）CeO2纳米棒的制备
将145 mg CeCl3·7H2O在磁力搅拌下溶解于20 mL无水乙醇中并加入1.3 mL0.75 mol/L的H2SO4，将得到的白色悬浮液转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，于130 °C下加热23 h，将产物离心分离后加入到饱和氢氧化钠醇溶液中静置5天，将产物洗涤干燥即得到CeO2纳米棒；
（2）CeO2-CuO纳米棒的制备
将6 mg Cu(CH3COO)2·H2O溶解到16 mL乙醇中，然后将60 mg CeO2纳米棒加入上述溶液中并在150 °C条件下反应12 h，将产物离心分离并在80 °C下干燥5 h制得CeO2-CuO纳米棒；
（3）Au纳米颗粒杂化氨基化CeO2-CuO纳米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs的制备
将制得的CeO2-CuO纳米棒加入到50 mL无水乙醇中，并加入1 mL三氨丙基三乙氧基硅烷70 °C下加热2 h，通过离心分离得到氨基化CeO2-CuO，将氨基化CeO2-CuO加入Au NPs洗涤干燥即得Au纳米颗粒杂化氨基化CeO2-CuO纳米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs。
实施例6 Au纳米颗粒杂化氨基化CeO2-CuO纳米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs分散液的制备
（1）CeO2纳米棒的制备
将200 mg CeCl3·7H2O在磁力搅拌下溶解于50 mL无水乙醇中并加入1.3 mL0.75 mol/L的H2SO4，将得到的白色悬浮液转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，于200 °C下加热50 h，将产物离心分离后加入到饱和氢氧化钠醇溶液中静置10天，将产物洗涤干燥即得到CeO2纳米棒；
（2）CeO2-CuO纳米棒的制备
将10 mg Cu(CH3COO)2·H2O溶解到16 mL乙醇中，然后将100 mg CeO2纳米棒加入上述溶液中并在200 °C条件下反应12 h，将产物离心分离并在80 °C下干燥10 h制得CeO2-CuO纳米棒；
（3）Au纳米颗粒杂化氨基化CeO2-CuO纳米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs的制备
将制得的CeO2-CuO纳米棒加入到50 mL无水乙醇中，并加入1 mL三氨丙基三乙氧基硅烷70 °C下加热2 h，通过离心分离得到氨基化CeO2-CuO，将氨基化CeO2-CuO加入Au NPs洗涤干燥即得Au纳米颗粒杂化氨基化CeO2-CuO纳米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs。
实施例7 Au@Ag异质结纳米棒负载硫堇的二抗标记物Au@Ag@Ab2@Th的制备
（1）Au@Ag异质结纳米棒的制备
将1 mg硝酸银、0.6 mL 20 mg/mL氯金酸及0.5640 g PDDA同时加入到140 mL乙二醇溶液中，在195 °C条件下反应80 h，将产物离心分离并用超纯水洗涤即得Au@Ag异质结纳米棒；
（2）Au@Ag异质结纳米棒负载硫堇的二抗标记物Au@Ag@Ab2@Th的制备
将0.5 mL 1.0 mg/mL Au@Ag异质结纳米棒样品溶于1.0 mL超纯水中，并加入0.1 mL的玉米赤霉烯酮抗体anti-ZEN和硫堇，4 °C下振荡1 h，得到的产物14500 rpm离心分离，固体重新分散在蒸馏水中即为Au@Ag异质结纳米棒负载硫堇的二抗标记物Au@Ag@Ab2@Th。
实施例8 Au@Ag异质结纳米棒负载硫堇的二抗标记物Au@Ag@Ab2@Th的制备
（1）Au@Ag异质结纳米棒的制备
将140 mg硝酸银、0.6 mL 20 mg/mL氯金酸及0.5640 g PDDA同时加入到140 mL乙二醇溶液中，在195 °C条件下反应80 h，将产物离心分离并用超纯水洗涤即得Au@Ag异质结纳米棒；
（2）Au@Ag异质结纳米棒负载硫堇的二抗标记物Au@Ag@Ab2@Th的制备
将0.5 mL 1.0 mg/mLAu@Ag异质结纳米棒样品溶于1.0 mL超纯水中，并加入0.1 mL的玉米赤霉烯酮抗体anti-ZEN和硫堇，4 °C下振荡3 h，得到的产物14500 rpm离心分离，固体重新分散在蒸馏水中即为Au@Ag异质结纳米棒负载硫堇的二抗标记物Au@Ag@Ab2@Th。
实施例9 Au@Ag异质结纳米棒负载硫堇的二抗标记物Au@Ag@Ab2@Th的制备
（1）Au@Ag异质结纳米棒的制备
将200 mg硝酸银、0.6 mL 20 mg/mL氯金酸及0.5640 g PDDA同时加入到140 mL乙二醇溶液中，在195 °C条件下反应80 h，将产物离心分离并用超纯水洗涤即得Au@Ag异质结纳米棒；
（2）Au@Ag异质结纳米棒负载硫堇的二抗标记物Au@Ag@Ab2@Th的制备
将0.5 mL 1.0 mg/mLAu@Ag异质结纳米棒样品溶于1.0 mL超纯水中，并加入0.1 mL的玉米赤霉烯酮抗体anti-ZEN和硫堇，4 °C下振荡5 h，得到的产物14500 rpm离心分离，固体重新分散在蒸馏水中即为Au@Ag异质结纳米棒负载硫堇的二抗标记物Au@Ag@Ab2@Th。
实施例10 玉米赤霉烯酮的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL的含有浓度为4 mmol/L铁氰化钾和10-2 mmol/L硝酸钾溶液中进行测试；
（2）用方波伏安法对玉米赤霉烯酮标准溶液进行检测，其电压测试范围为0V ~ 0.6V；
（3）当背景电流趋于稳定后，通过记录玉米赤霉烯酮加入前后的传感器的峰电流值的变化，绘制工作曲线。
实施例11 玉米赤霉烯酮的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL的含有浓度为5 mmol/L铁氰化钾和1 mmol/L硝酸钾溶液中进行测试；
（2）用方波伏安法对玉米赤霉烯酮标准溶液进行检测，其电压测试范围为0V ~ 0.6V；
（3）当背景电流趋于稳定后，通过记录玉米赤霉烯酮加入前后的传感器的峰电流值的变化，绘制工作曲线。
实施例12 玉米赤霉烯酮的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL的含有浓度为6 mmol/L铁氰化钾和10 mmol/L硝酸钾溶液中进行测试；
（2）用方波伏安法对玉米赤霉烯酮标准溶液进行检测，其电压测试范围为0V ~ 0.6V；
（3）当背景电流趋于稳定后，通过记录玉米赤霉烯酮加入前后的传感器的峰电流值的变化，绘制工作曲线。