高负载及pH可控释放阿霉素的纳米钻石药物制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米药物，具体涉及一种高负载及pH可控释放阿霉素的纳米钻石药物及其制备方法，以及该药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002]癌症严重危害着人类的生命健康，其发病率和死亡率在全世界范围内仅次于心脏病和传染疾病。目前，癌症的主要治疗手段有手术切除、放射疗法和化学疗法三种。如果肿瘤只在某个局部范围内生长或发现时间较早，适合采用手术切除和放射疗法这两种治疗手段。但是，通常病人发现肿瘤的时候己经处于癌症中晚期，且常常伴随着病灶转移和扩散的迹象，这种情况下化学疗法才是病人存活的唯一希望。传统的化学疗法是通过口服或静脉注射抗癌药物(如阿霉素、喜树碱、紫杉醇、顺铀等，使这些抗癌药物经血液循环系统到达肿瘤部位，以此杀死癌细胞。然而，这些临床中使用的抗癌药物通常具有很强的细胞毒性，并且缺乏特异识别性，在杀死癌细胞的同时，也会杀死正常的组织细胞。此外，化学疗法还存在药物生物利用率低的缺点，具体表现为癌细胞对药物的摄入效率较低，药物在血液循环过程中难以跨过生理障碍到达肿瘤部位。这些问题都不同程度地限制了抗癌药物的使用剂量和应用范围，阻碍了化学疗法在癌症治疗中的应用，亟待人们的解决。
[0003]纳米材料由于具有独特的尺寸优势，靶向功能，可跨越生理屏障，多功能性，能增溶疏水性药物，可提高药物的稳定性，对药物的可控释放，降低药物的毒副作用等化学和物理特性，使其在药物传输方面具有很多优越性，受到了材料科学家和临床医生的重视并得到了广泛的研究。纳米钻石因其具有低毒性、高生物相容性和表面易修饰特性，将其作为载体制备纳米药物时受到了众多研究者的青睐。PEG在水溶液和一些溶剂中具有极好的溶解性，无毒且具有低的免疫原性，这使其制备过程具有灵活性且在制备肿瘤药物中得到了广泛应用。基于此，本文以H2N-PEG-COOH修饰纳米钻石，在柠檬酸钠或醋酸钠作用下物理吸附化疗药物阿霉素制备得到高负载及PH控释的纳米药物，并研究了该种药物的抗肿瘤活性。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种高负载及pH可控释放阿霉素的纳米钻石药物及其制备方法，以及该药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0005]本发明提供的一种高负载及pH可控释放阿霉素的纳米钻石药物的制备方法，包括如下步骤:
[0006](I)取真空干燥的羧基化纳米钻石，按每毫克羧基化纳米钻石加入1-1.5mL的浓度为0.1M、pH为5.8的MES缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，再按每毫克羧基化纳米钻石加入0.2mg EDC, 0.25mg NHS，室温搅拌反应6h，反应完毕后以15000rpm高速离心5min弃除上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；接着将活化羧基的纳米钻石沉淀物迅速分散到浓度为0.1Μ、ρΗ为8.4的硼酸缓冲溶液中，经过短暂超声分散形成悬浊液，再按每毫克活化的羧基化纳米钻石快速加入0.3mg聚乙二醇(H2N-PEG-COOH)，继续室温搅拌反应12h，待反应结束，以15000rpm高速离心5min吸除上清液，并用0.1Μ、ρΗ 8.4的硼酸缓冲溶液高速离心洗涤三次，获得纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)沉淀物；
[0007](2)取真空干燥的纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH) lmg,按每毫克ND-PEG-C00H加入l_1.5mL柠檬酸钠(Na3Cit, 1.0M)溶液，超声分散I小时形成悬浊液，再按每毫克ND-PEG-C00H加入0.1-0.2mg阿霉素(DOX)，避光于摇匀仪上反应6小时，待反应完毕，以15000rpm高速离心5min收集上清液，并用1.0M朽1檬酸钠(Na3Cit)继续以15000rpm高速离心5min洗涤三次，制得纳米钻石-聚乙二醇-阿霉素/柠檬酸钠(ND-PEG-D0X/Na3Cit)纳米药物，真空干燥，冷藏，避光保存。
[0008]所述的柠檬酸钠可以用醋酸钠替代。
[0009]上述制备的高负载及pH可控释放阿霉素的纳米钻石药物可以在制备抗肿瘤药物中应用。
[0010]与现有技术相比本发明的有益效果:本发明选用的纳米钻石材料具有生物相容性好、无毒、化学性质稳定、表面易修饰等诸多优点；PEG因其在水溶液和一些溶剂中具有极好的溶解性、无毒且具有低的免疫原性等优势，使制备过程具有灵活性。与本实验室前期研究相比较，本文发明的纳米药物其载药量比之高了 5-6倍，且在肿瘤环境中的释药率高达到80%，而在正常组织环境中却相对稳定，释药率仅为7%，这均比前期研究略胜一筹。通过纳米载体ND-PEG与人肝癌细胞0fepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)作用，表明ND-PEG载体具有生物兼容性；将纳米载体纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG)在柠檬酸钠或醋酸钠作用下，物理吸附阿霉素，制备得到ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG_D0X/NaAc纳米药物，通过流式细胞仪检测细胞摄取ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG_D0X/NaAc实验，表明ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG_D0X/NaAc均可以进入细胞，从而诱导细胞凋亡，经MTT实验检测药物对细胞的活性，表明该纳米药物不仅可以降低化疗药物对正常细胞的毒副作用，而且能提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力，所以ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc可在制备抗肿瘤药物中应用。
【附图说明】
[0011]图1各种纳米颗粒的红外光谱图
[0012]图2A不同pH对纳米药物ND-PEG-D0X/Na3Cit体外释药的影响
[0013]图2B不同pH对纳米药物ND-PEG-D0X/NaAc体外释药的影响
[0014]图3A用流式细胞仪检测MCF-7细胞的散点图
[0015]图3B用流式细胞仪检测MCF-7细胞摄取ND_PEG_D0X/Na3Cit的散点图
[0016]图3C用流式细胞仪检测MCF-7细胞摄取ND-PEG_D0X/NaAc的散点图
[0017]图4A用流式细胞仪检测MCF-7细胞的荧光强度图
[0018]图4B用流式细胞仪检测MCF-7细胞摄取ND_PEG_D0X/Na3Cit的荧光强度图
[0019]图4C用流式细胞仪检测MCF-7细胞摄取ND-PEG_D0X/NaAc的荧光强度图
[0020]图5A不同浓度的纳米药物ND-PEG-D0X/Na3Cit对体外培养H印G2细胞活性的影响
[0021]图5B不同浓度的纳米药物ND-PEG-D0X/Na3Cit对体外培养HeLa细胞活性的影响
[0022]图5C不同浓度的纳米药物ND-PEG-D0X/Na3Cit对体外培养MCF-7细胞活性的影响
[0023]图6A纳米药物ND-PEG-D0X/Na3Cit对体外培养不同时间HepG2细胞活性的影响
[0024]图6B纳米药物ND-PEG-D0X/Na3Cit对体外培养不同时间HeLa细胞活性的影响
[0025]图6C纳米药物ND-PEG-D0X/Na3Cit对体外培养不同时间MCF-7细胞活性的影响
[0026]图7A纳米药物ND-PEG-DOX/NaAc对体外培养不同时间MCF-7细胞活性的影响
[0027]图7B纳米药物ND-PEG-DOX/NaAc对体外培养不同时间HeLa细胞活性的影响
[0028]图7C纳米药物ND-PEG-DOX/NaAc对体外培养不同时间MCF-7细胞活性的影响
【具体实施方式】
[0029]以下为实施例中使用的材料:
[0030]纳米钻石(ND，元素六，直径大约140nm, Ireland)。
[0031]阿霉素(DOX)是盐酸多柔比星，分子式为C27H29NO11.HCl，分子量为579.99，深圳万乐药业有限公司，规格按C27H29NO11.HCl计算为10mg。
[0032]聚乙二醇(H2N-PEG-COOH,分子量为2000)为上海西宝生物有限公司生产。
[0033]二水合柠檬酸钠(C6H5Na3O7.2H20，分子量为294.10)为阿拉