吸收峰表明阿霉素成功吸附到了纳米钻石-聚乙二醇表面，也表面纳米钻石-聚乙二醇-阿霉素/醋酸钠(ND-PEG-DOX/NaAc)纳米粒子中有醋酸钠的存在。
[0054]实施例5
[0055]不同pH对纳米药物ND-PEG_D0X/Na3Cit体外释药的影响
[0056]纳米药物ND-PEG-D0X/Na3Cit 的体外释放实验在 37 °C 下 PBS (0.01M, pH 5.0)、PBS(0.01M, pH 6.5)、PBS(0.01M，pH 7.4)三种条件下进行。分别取三分等量纳米药物ND-PEG-D0X/Na3Cit或ND-PEG-DOX/NaAc悬浊分散于相应介质溶剂中并放入释放用透析袋中，透析袋分别浸入9mL上述三种缓冲溶液介质中，置于37°C恒温震荡仪中，在每个取样时间点，取走2mL溶液用于紫外测试，另外补加2mL对应的新鲜透析溶剂。取出的2mL溶液通过阿霉素(DOX)在485nm处的吸光度从而测定其含量。
[0057]图2A为纳米药物ND-PEG-D0X/Na3Cit在不同pH下体外释药曲线，结果可以看出，在生理条件(PBS，pH 7.4)下，纳米药物ND-PEG-D0X/Na3Cit很稳定，经过长达约50个小时后累计释药率才为7%左右，而在酸性条件PBS (0.01M，pH 5.0)、PBS (0.01M，pH 6.5)下，纳米药物ND-PEG-D0X/Na3Cit的释放率大于正常生理条件下，且随着酸性的增加(pH值的减小)，阿霉素的释放速率越来越快，释药量也不断增多，尤其在PBS (0.01M，pH 5.0)酸性条件下，累计释放率达到了约80%。研究表明，人体的血液和正常组织的pH值为7.4，在此pH值下，纳米药物ND-PEG-D0X/Na3Cit释放阿霉素的速率很缓慢，这就避免了 ND-PEG-DOX/Na3Cit在血液循环的过程中释放大量药物，从而减少正常组织对阿霉素(DOX)的摄取和吸收，降低药物对正常组织和细胞的毒副作用。表明纳米药物ND-PEG-D0X/Na3Cit可以应用于肿瘤治疗。图2B为纳米药物ND-PEG-DOX/NaAc在不同pH下体外释药曲线，结果可以看出，在生理条件(PBS，pH 7.4)下，纳米药物ND-PEG-DOX/NaAc很稳定，经过长达约70个小时后累计释药率才为9.6%左右，而在酸性条件PBS (0.01M, pH 5.0)、PBS (0.01M, pH 6.5)下，纳米药物ND-PEG-DOX/NaAc的释放率大于正常生理条件下，且随着酸性的增加(pH值的减小)，阿霉素的释放速率越来越快，释药量也不断增多，约为正常组织生理条件下的四倍。研究表明，人体的血液和正常组织的pH值为7.4，在此pH值下，纳米药物ND-PEG-DOX/NaAc释放阿霉素的速率很缓慢，这就避免了 ND-PEG-DOX/NaAc在血液循环的过程中释放大量药物，从而减少正常组织对阿霉素(DOX)的摄取和吸收，降低药物对正常组织和细胞的毒副作用。表明纳米药物ND-PEG-DOX/NaAc可以应用于肿瘤治疗。
[0058]实施例6
[0059]流式细胞仪检测体外MCF-7细胞摄取纳米钻石-聚乙二醇-阿霉素-柠檬酸钠(ND-PEG-D0X/Na3Cit)实验
[0060]取对数生长期的MCF-7细胞以2.0X 105/dish的密度接种于35mm培养皿中，培养16h后，弃除上清液，PBS洗涤三次，本实验中用实施例1制备的ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc 纳米药物，分别加入 ND_PEG_D0X/Na3Cit 或 ND-PEG-DOX/NaAc (含 5 μ g/ml D0X)纳米药物于37°C孵育2h，孵育完毕，收集细胞，加入buffer缓冲液，通过流式细胞仪测定其红色荧光强度(488nm激发波长)信号，以未做任何处理的细胞为对照。
[0061]图3A、图3B和图3C为MCF-7细胞的前向散射光强度(forward scatterintensity，FSC)和侧向散射光强度(side scatter intensity，SSC)的散点图，FSC 反映细胞的相对大小，SSC反映细胞内颗粒物质的复杂程度，颗粒越多，SSC散射强度就越大。由图3B及图3C和图3A比较，观察到当ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc纳米药物与细胞作用后的SSC信号明显强于细胞本身的SSC强度，表明细胞内的颗粒物增多，这是由于纳米药物ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc大量进入细胞内导致，说明了ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc纳米药物可以进入MCF-7细胞。而两者FSC的强度没有明显差异，表明细胞的大小基本未发生变化，说明纳米药物对细胞本身性质不会产生影响。由于DOX以488nm为激发波长时，在500-700nm有荧光信号产生，因此通过检测细胞内ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc的荧光强度，间接反映细胞摄取ND-PEG-DOX/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc量的多少。图4A是未经处理的细胞所检测到的荧光信号强度，是细胞自发荧光，即细胞内部的荧光分子经光照射后所产生的荧光；图4B是含5 μ g/mlDOX的ND-PEG-D0X/Na3Cit与细胞作用2h后所检测到的荧光信号强度图，图4C是含5 μ g/ml DOX的ND-PEG-DOX/NaAc与细胞作用2h后所检测到的荧光信号强度图，可以看到，用ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc处理细胞的荧光强度明显大于细胞本身的荧光强度，再次表明ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc已进入细胞，与图3结果一致。
[0062]实施例7
[0063]不同浓度ND-PEG-D0X/Na3Cit纳米药物对人肝癌细胞(H印G2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)活性的影响
[0064]将处于对数生长期的人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)细胞(10% FBS/DMEM培养基，5% CO2, 37°C )按每孔5X 13个接种于96孔培养板，细胞贴壁后，换200 μ L 10% FBS/DMEM培养基配制的各实验组(A =ND-PEG 5.88 μ g/mL、ND-PEG-D0X/Na3Cit 5.88 μ g/mL (含 DOX I μ g/mL) ；Β: ND-PEG 17.65 μ g/mL、ND-PEG-DOX/Na3Cit 17.65 μg/mL (含 DOX 3 μ g/mL) ；C:ND-PEG 29.41 μg/mL、ND-PEG-DOX/Na3Cit29.41 μ g/mL (含 DOX 5 μ g/mL) ；D:ND-PEG 41.18 μ g/mL、ND-PEG_D0X/Na3Cit 4 μ g/mL(含 DOX 7 μ g/mL) ；E:ND-PEG 52.94 μ g/mL、ND-PEG_D0X/Na3Cit 52.94yg/mL(含D0X9 μ g/mL)，每组均以未处理的H印G2、HeLa, MCF-7细胞为空白对照组，每组设置6个复孔，培养72h后每孔加入20 μ L5mg/mL MTT的PBS溶液，继续培养4h，然后弃除孔内旧培养液，每孔加入150 μ L DMSO，均勾振摇lOmin，进行酶标仪上机检测。
[0065]图5A为各药物组对体外IfepG2细胞增殖的影响，图5B为各药物组对体外HeLa细胞增殖的影响，图5C为各药物组对体外MCF-7细胞增殖的影响。与空白细胞组对照，发现纳米材料载体ND-PEG在不同浓度条件下，对IfepG2、HeLa, MCF-7三种细胞活性几乎没有影响，表明ND-PEG载体具有生物兼容性；而纳米药物ND-PEG-D0X/Na3Cit对H印G2、HeLa,MCF-7三种细胞均表现出不同程度的杀伤作用，对IfepG2细胞和MCF-7细胞的杀伤性较敏感，均表现为在低浓度(I μ g/mL)时杀伤力不强，当浓度逐渐增大时，杀伤力增强，在浓度为5 μ g/mL时对HepG2细胞杀伤力达到饱和，细胞存活率降到约为20%，在浓度为3 μ g/mL时对MCF-7细胞杀伤力达