一种干燥介导金纳米颗粒自组装制备金基底的方法及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种干燥介导金纳米颗粒自组装制备金基底的方法及其应用，先在金纳米颗粒上修饰mPEG?SH；然后高温干燥介导mPEG?SH修饰的金纳米颗粒在96孔板基底组装；接着在组装了金纳米颗粒的基底上沉积金原子，形成均一的金基底；该方法可以用于ELISA检测反应，具有简单、快捷和试剂用量少的优点，能够有效避免检测过程中的非特异性吸附，为环境监测和疾病诊断提供新的平台。
【专利说明】
一种干燥介导金纳米颗粒自组装制备金基底的方法及其应用
技术领域
[0001 ]本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种干燥介导金纳米颗粒自组装制备金基底的方法，及其在ELISA检测技术上的应用。
【背景技术】
[0002]酶联免疫吸附测定(EnzymeLinked Immunosorbent Assay，ELISA)是一种基于抗原抗体特异性相互作用的检测反应。利用ELISA检测靶标主要是通过双抗体夹心的方法进行，即首先在基底上固定捕获抗体，然后利用抗原抗体的特异性相互作用，在捕获抗体上依次固定抗原和检测抗体，最后通过检测抗体上标记的酶分子催化底物显色、发光或产气测定靶标浓度。另外还有双抗原夹心法等。目前，ELISA已经被广泛的应用于蛋白质、小分子、细胞、细菌等靶标的检测，在环境监测、食品安全和疾病诊断等领域占有重要地位。利用ELISA方法进行检测有特异性好、稳定和灵敏度高的优点，然而，在ELISA检测靶标时，需要在4°C孵育12h来完成基底上捕获抗体的包被过程，因此十分耗时；并且，由于抗体与ELISA检测常用的96孔板基底亲和力弱，包被抗体时试剂消耗量大。与96孔板基底不同，金基底与抗体亲和力强、结合速度快，利用金基底进行ELISA检测能够有效降低试剂的用量和缩短抗体包被所用的时间。然而，目前制备金基底的方法多是基于电镀或真空蒸镀的方法，该方法需要用到大型仪器，成本高且试剂消耗量大。
[0003]因此，发展简单、快速、试剂消耗小且无需大型仪器的方法制备金基底，对于缩短ELISA包被抗体所用时间、降低试剂用量具有重大意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种干燥介导金纳米颗粒自组装制备金基底的方法及其应用，具有简单、快捷、廉价的优点，也解决了现有ELISA技术中包被捕获抗体耗时长、试剂用量大等不足。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是:
[0006]—种干燥介导金纳米颗粒自组装制备金基底的方法，包括:
[0007]I)将粒径5?30nm的金纳米颗粒用浓度为0.2?5μΜ、分子量为0.75?20kDa的mPEG-SH(甲氧基巯基修饰的聚乙二醇)修饰，得到mPEG-SH修饰的金纳米颗粒；
[0008]2)在65?95°C下干燥，以介导浓度为I?25nM的上述mPEG-SH修饰的金纳米颗粒在酶标板的聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或纤维素等高分子材料制成的基底上自组装形成均勾的金纳米颗粒层;mPEG-SH在修饰过程中能够与金纳米颗粒完全、充分地结合，并能够在自组装过程中促进金纳米颗粒均匀分布;在65?95°C下干燥能够在迅速除去水分的同时促进溶液流动，从而在加快速度的同时进一步保障形成均匀的金纳米颗粒层；
[0009]3)利用还原剂还原浓度不低于0.31mM的氯金酸的方法在步骤2)得到的均匀的金纳米颗粒层上沉积金原子，从而在酶标板内形成均一的金基底。所述还原剂可以是盐酸羟胺、抗坏血酸、对苯二酚或柠檬酸钠等，优选盐酸羟胺。通过还原剂与氯金酸的量可以调控生成的金基底的厚度。
[00?0] —实施例中:所述步骤I)中，金纳米颗粒的粒径为13?20nm。
[0011]一实施例中:所述步骤I)中，mPEG-SH的分子量为5kDa。
[0012]一实施例中:所述步骤I)中，mPEG-SH的终浓度为0.5?ΙμΜ。
[0013]一实施例中:所述步骤2)中，温度为75?85°C
[0014]一实施例中:所述步骤2)中，mPEG-SH修饰的金纳米颗粒浓度为2.5?ΙΟηΜ。
[0015]—实施例中:所述步骤3)中，所述还原剂为盐酸羟胺，盐酸羟胺的反应浓度为2?5 OmM ο
[0016]—实施例中:所述盐酸羟胺的反应浓度为5?20mM。
[0017]一实施例中:所述步骤3)中，所述氯金酸的浓度为10?20mM。
[0018]本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是:
[0019]上述方法在ELISA检测技术中的应用，所述ELISA检测的靶标可以是细胞、蛋白质和小分子等，可以用于直接法、间接法、双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争法等。
[0020]本技术方案与【背景技术】相比，它具有如下优点:
[0021 ]首先，通过干燥介导自组装的方法使mPEG-SH修饰的金纳米颗粒吸附于96孔板基底，此法吸附金纳米颗粒均一性好;其次，利用盐酸羟胺还原氯金酸在基底上沉积金原子，简单、廉价、试剂消耗小且形成金基底的厚度可控;再次，利用金基底与抗体的强吸附作用，进行ELISA检测包被捕获抗体时能够减少试剂用量、缩短包被所用的时间；最后，此方法制备的金基底适用于蛋白质、小分子、细胞和细菌等多种靶标的ELISA检测。基于此方法拥有简单、快捷、廉价和试剂消耗量少的优点，将进一步促进ELISA检测方法的发展。
【附图说明】
[0022]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0023]图1为本发明干燥介导金纳米颗粒自组装制备金基底用于ELISA检测的原理图。
[0024]图2为实施例1中不同浓度不同分子量mPEG-SH修饰金纳米颗粒在96孔板基底组装制备金基底的(A)实物照片和(B)在405nm的吸收。
[0025]图3为实施例1中不同浓度氯金酸制备金基底的(A)实物照片和(B)基底在405nm的吸收。
[0026]图4为实施例1中干燥介导金纳米颗粒自组装制备金基底的扫描电镜图。
[0027]图5为实施例2中lyg/mL(A)HRP和(B)SA-HRP在金基底和96孔板基底上吸附的动力学过程。
[0028]图6为实施例2中不同浓度(A)HRP和(B)SA-HRP在金基底和96孔板基底上孵育Ih能够吸附的量。
[0029]图7为实施例3中利用(A)金基底和(B)96孔板进行ELISA检测不同浓度H5N1的结果示意图。
【具体实施方式】
[0030]下面通过实施例具体说明本发明的内容:
[0031 ]实施例1:干燥介导金纳米颗粒自组装制备金基底
[0032]I)合成16nm金纳米颗粒(AuNPs):在圆底烧瓶中加入10mL 0.01wt%氯金酸，在连续搅拌下煮沸回流，勾速加入ImL 3wt%梓檬酸钠，继续搅拌煮沸30min，合成粒径为16nm的AuNPs。根据紫外可见吸收表征此方法合成金纳米颗粒的浓度为2.5nM。
[0033]2)在96孔酶标板中加入10yL上述2.5nM 16nm AuNPs和5yL不同浓度不同分子量的mPEG-SH，混合均匀，得到mPEG-SH修饰的金纳米颗粒；
[0034]3)在800C下干燥，以介导步骤2)得到的mPEG-SH修饰的金纳米颗粒在96孔酶标板的基底上自组装形成均匀的金纳米颗粒层；
[0035]4)然后加入50yL不同浓度氯金酸和50yL 20mM盐酸羟胺，25°C反应30min，利用盐酸羟胺还原氯金酸的方法在步骤3)得到的均匀的金纳米颗粒层上沉积金原子，从而在96孔酶标板内形成均一的金基底。用超纯水洗涤3次，利用酶标仪测定不同样品在405nm的吸收以对比不同条件下的效果;利用扫描电镜表征金基底的形貌，结果如图4所示。
[0036]酶标仪测定结果如图2和图3所示，mPEG-SH的分子量以5kDa为佳，浓度以0.5?ΙμΜ为佳;氯金酸的浓度以I OmM为佳。
[0037]实施例2:金基底吸附蛋白的动力学过程表征
[0038]在实施例1得到的具有金基底的96孔酶标板内加入10yL不同浓度HRP(过氧化物酶)或SA-HRP(链霉亲和素/过氧化物酶)，室温孵育不同时间，然后用PBS洗涤3次。再加入10yL商品化的TMB底物，室温反应20min，加入50yL 2M H2SO4终止反应，利用酶标仪测定不同样品在450nm的吸收。对照组采用常规的96孔酶标板，操作同上。
[0039]结果如图5和图6所示，金基底吸附蛋白的速度和吸附量远远大于常规96孔酶标板，利用金基底进行ELISA检测能够有效降低试剂的用量和缩短抗体包被所用的时间。
[0040]实施例3:本发明在ELISA检测技术中的应用[0041 ]利用本发明的方法检测H5N1:
[0042]在实施例1得到的具有金基底的96孔酶标板内加入10yL 2yg/mL捕获抗体，4°C孵育 30min，300yL Wash Buffer (含有0.Iwt % Tween 20PBS 溶液)洗涤三遍。随后，加入300yL2wt %BSA/PBS溶液，37°C孵育Ih，300yL Wash Buf f er洗涤三遍。加入10yL待测样品，25°C孵育lh，300yL Wash Buffer洗涤三遍。然后加入10yL 0.5yg/mL生物素标记的检测抗体，25°C孵育lh，300yL Wash Buffer洗涤两遍。然后加入10yL 1: 200稀释的商品化SA_HRP，25°C孵育Ih，300yL Wash Buffer洗涤两遍。加入10yL商品化的TMB底物，室温反应20min，加A50yL 2M H2SO4终止反应，利用酶标仪测定不同样品在450nm的吸收。对照组采用常规的96孔酶标板，操作同上。
[0043]结果如图7所示，采用本发明组装金基底后的酶标板进行检测，与常规的96孔酶标板检测相比，二者线性良好，结果无显著性差异。
[0044]以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
【主权项】
1.一种干燥介导金纳米颗粒自组装制备金基底的方法，其特征在于:包括: 1)将粒径5?30nm的金纳米颗粒用浓度为0.2?5μΜ、分子量为0.75?20kDa的mPEG-SH修饰，得到mPEG-SH修饰的金纳米颗粒； 2)在65?950C下干燥，以介导浓度为I?25nM的上述mPEG-SH修饰的金纳米颗粒在酶标板基底上自组装形成均匀的金纳米颗粒层； 3)利用还原剂还原浓度不低于0.31mM的氯金酸的方法在步骤2)得到的均匀的金纳米颗粒层上沉积金原子，从而在酶标板内形成均一的金基底。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤I)中，金纳米颗粒的粒径为13?20nmo3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤I)中，mPEG-SH的分子量为5kDa。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤I)中，mPEG-SH的终浓度为0.5?IμΜο5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤2)中，温度为75?85°C。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤2)中，mPEG-SH修饰的金纳米颗粒浓度为2.5?ΙΟηΜ。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤3)中，所述还原剂为盐酸羟胺，盐酸羟胺的反应浓度为2?50mM。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述盐酸羟胺的反应浓度为5?20mM。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤3)中，所述氯金酸的浓度为10?2OmM ο10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法在ELISA检测技术中的应用。
【文档编号】G01N33/544GK105925963SQ201610347942
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】杨朝勇, 李久兴, 刘芳, 何梦逸, 朱志
【申请人】厦门大学