紫杉醇-油酸小分子前药自组装纳米粒的构建的制作方法
【专利摘要】本发明设计合成了一系列紫杉醇?油酸小分子前药，通过使用对氧化还原环境敏感的化学连接臂，促进药物在肿瘤细胞内快速释放。在此基础上，制备了小分子前药自组装纳米药物传递系统。这些小分子前药纳米药物传递系统的优势在于：采用一步纳米沉淀的方法，制备工艺简单，易于产业化；粒径小且均匀（~100 nm），易于通过EPR效应富集于肿瘤部位；超高的载药量，有利于减小因辅料和生物材料而引发的不良反应；易于表面修饰，可通过PEG和主动靶向修饰以有效避免网状内皮系统摄取和提高肿瘤细胞对纳米粒的摄取；借助化学链接臂对肿瘤细胞氧化还原微环境的敏感性，实现紫杉醇在肿瘤部位的特异性释药，提高疗效并降低毒副作用。
【专利说明】
紫杉醇-油酸小分子前药自组装纳米粒的构建
技术领域
[0001] 本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，包括多个紫杉醇-油酸前药的合成及 系列紫杉醇-油酸小分子前药自组装纳米粒的构建，以及其在药物传递中的应用。
【背景技术】
[0002] 紫杉醇(Paclitaxel ,ΡΤΧ)作为一线抗癌药已经被广泛应用于临床中。由于紫杉醇 的水溶性很差，市售的溶液剂(泰素)是用聚氧乙烯蓖麻油和乙醇作为增溶剂和助溶剂将其 溶解而应用于临床。正因如此，泰素会引起很严重的辅料相关的毒副作用，极大地限制了其 在临床的应用。近年来，基于纳米技术的新型药物传递系统备受关注，有很多纳米药物传递 系统被构建起来用于紫杉醇的递药。其中，有一些已经被应用于临床实践中，包括紫杉醇脂 质体、紫杉醇白蛋白纳米粒、紫杉醇纳米胶束以及紫杉醇-聚合物前药等。尽管纳米技术极 大地改善了紫杉醇的成药性，但这些新型纳米制剂也存在一些缺陷，包括:载体相关的毒 性、载药量低(一般不足10%)、稳定性差、药物在储存过程中易泄漏、结晶等。因此，如何设 计一种高效低毒的药物传递系统用于紫杉醇的传递仍然是研究的热点。
[0003] 前体药物也被广泛研究用来克服紫杉醇的成药性差问题。其中，关于紫杉醇的不 饱和脂肪酸前药的研究取得了很大的进展。例如：紫杉醇-二十二碳六烯酸前药(PTX-DHA) 已经进入了临床III期研究。然而，最新的临床结果显示，与现存的化疗药物相比，PTX-DHA 的疗效并没有展现出优势。分析PTX-DHA的结构，我们发现紫杉醇和二十二碳六烯酸是通过 酯键相连的，这可能会导致紫杉醇很难从前药上断裂下来，进而导致其疗效不佳。
【发明内容】
[0004] 针对这一问题，我们设计了一系列紫杉醇-油酸前药，紫杉醇和油酸是通过一系列 氧化还原敏感的化学连接臂连接在一起，这些氧化还原敏感的化学连接臂在肿瘤细胞内的 高氧化还原环境中能快速断裂，释放出药物。令人惊喜的是，我们发现这些小分子疏水性前 药能自组装形成均匀的前药纳米粒。在这些小分子前药纳米系统中，由于前药自身既作为 载体材料又作为被包载的药物，其载药量非常高，超过了 50%。如此高的载药量在所有紫杉 醇纳米制剂中极为罕见。在此基础上，比较了氧化还原敏感的化学连接臂对紫杉醇释放速 率及其对抗肿瘤效果的影响。
[0005] 基于此，本发明设计构建了一系列氧化还原敏感的紫杉醇-油酸小分子前药纳米 粒，并对其进行了 PEG修饰，赋予其在血液中的长循环特性，将其应用于抗肿瘤研究。
[0006] 本发明的目的是设计和合成一系列氧化还原敏感的紫杉醇-油酸小分子前药，制 备前药自组装纳米药物传递系统，并比较不同化学连接臂(酯键和氧化还原敏感键)对药物 释放速率和抗肿瘤效果的影响。
[0007] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：
[0008] 本发明所述的紫杉醇-油酸小分子前药包括(a)酯键相连的紫杉醇-油酸前药、（b) 单硫醚键相连的紫杉醇-油酸前药、（c)间隔二硫醚键相连的紫杉醇-油酸前药和(d)二硫键 相连的紫杉醇-油酸前药，其结构如下：
[0010] 本发明提供的系列紫杉醇-油酸小分子前药合成方法，包括如下步骤：
[0011] (1)酯键相连的紫杉醇-油酸前药的合成:油酸在DCC和DMAP的催化下，与紫杉醇在 N2保护下反应，分离纯化即得；
[0012] (2)氧化还原双敏感的单硫醚键相连的紫杉醇-油酸前药的合成:油酸在对甲苯磺 酸催化下，与乙二醇反应，得油酸-乙二醇酯，油酸-乙二醇酯在HOBt和EDCI的催化下，与2， 2硫代二乙酸酐反应，得(2-氧代-2-(2-( (Z)-油酰氧基）乙氧基）乙硫基）乙酸，（2-氧代-2-(2-( (Z)-油酰氧基）乙氧基）乙硫基）乙酸在HOBt和EDCI的催化下，与紫杉醇反应，分离纯 化即得，反应全程都在他保护下进行，乙二醇也可以用乙二胺替代；
[0013] (3)氧化还原双敏感的间隔二硫醚键相连的紫杉醇-油酸前药的合成:油酸在对甲 苯磺酸催化下，与乙二醇反应，得油酸-乙二醇酯，油酸-乙二醇酯在HOBt和EDCI的催化下， 与1，2-亚乙基二硫代二乙酸酐反应，得(2-(2-氧代-2-(2-( (Z)-油酰氧基）乙氧基）乙硫基） 乙硫基）乙酸，（2-(2-氧代-2-(2-( (Z)-油酰氧基）乙氧基）乙硫基）乙硫基）乙酸在HOBt和 EDCI的催化下，与紫杉醇反应，分离纯化即得，反应全程都在犯保护下进行，乙二醇也可以 用乙二胺替代；
[0014] (4)还原敏感的二硫键相连的紫杉醇-油酸前药的合成：油酸在对甲苯磺酸催化 下，与乙二醇反应，得油酸-乙二醇酯，油酸-乙二醇酯在HOBt、EDCI和DMAP的催化下，与2， 2'-二硫代二乙酸酐反应，得(2-氧代-2-(2-(⑵-油酰氧基）乙氧基）乙二硫基）乙酸，（2-氧 代-2-(2-( (Z)-油酰氧基）乙氧基）乙二硫基）乙酸在HOBt和EDCI的催化下，与紫杉醇反应， 分离纯化即得，反应全程都在他保护下进行，乙二醇也可以用乙二胺替代。
[0015] 本发明提供的小分子前药自组装纳米粒的制备方法如下：
[0016] 将一定量的小分子前药溶解到适量的乙醇中，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到 水中，前药自发形成均匀的纳米粒。
[00?7 ]所述的小分子前药纳米粒可以为非PEG化的小分子前药纳米粒、PEG修饰的小分子 前药纳米粒、包载疏水性荧光物质或药物的小分子前药纳米粒和主动靶向的小分子前药纳 米粒。
[0018] (1)非PEG化的小分子前药自组装纳米粒的制备方法:将一定量的前药溶解到适量 的乙醇中，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。
[0019] (2)PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的制备方法:将一定量的TPGS2_前药溶 解到适量的乙醇中，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。
[0020] (3)包载疏水性荧光物质或药物的小分子前药自组装纳米粒的制备方法:将一定 量的TPGS 2k、香豆素-6或DiR以及前药溶解到适量的乙醇中，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加 到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。
[0021] (4)主动靶向的小分子前药自组装纳米粒的制备方法：将一定量的TPGS2k、DSPE-PEG-AA以及前药溶解到适量的乙醇中，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到水中，前药自发形 成均勾的纳米粒。
[0022] 本发明的脂肪酸-紫杉醇小分子前药首次被发现可以自组装形成均匀的纳米体 系。该纳米药物传递系统的优势在于：（1)采用一步纳米沉淀的方法，制备工艺简单，易于产 业化；（2)粒径小且均一(~100nm)，有利于纳米粒通过EPR效应富集于肿瘤部位；（3)超高的 载药量，有利于减小因辅料和生物材料而引发的不良反应；⑷易于表面修饰，可通过PEG和 主动靶向修饰以有效避免网状内皮系统摄取和提高肿瘤细胞对纳米粒的摄取；（5)通过链 接臂对肿瘤部位细胞内环境的敏感性，实现紫杉醇在肿瘤细胞内的特异性释药，提高疗效 的同时降低毒副作用。
[0023] 本发明具有以下有益效果：1.设计合成了一系列新的紫杉醇-油酸小分子前药，合 成方法简单易行；2.通过设计和对比不同化学连接臂，能有效促进紫杉醇在肿瘤细胞内从 前药中快速被水解释放出来;3.制备了均匀的小分子前药自组装纳米粒，制备方法简单易 行，稳定性好，载药量高;4. PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒能有效延长药物在血液中 的循环时间；5.所制备的小分子前药自组装纳米粒具有良好的抗肿瘤效果。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明实施例1的酯键相连的紫杉醇-油酸前药(ΡΤΧ-0Α)的1HNMR谱图。
[0025] 图2为本发明实施例2的单硫醚键相连的紫杉醇-油酸前药(PTX-S-0A)的1HNMR谱 图。
[0026] 图3为本发明实施例3的间隔二硫醚键相连的紫杉醇-油酸前药(PTX-2S-0A)的 ^NMR谱图。
[0027]图4为本发明实施例4的二硫键相连的紫杉醇-油酸前药(PTX-S-S-0A)的1HNMR谱 图。
[0028]图5为本发明实施例6的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的透射电子显微镜 图。
[0029] 图6为本发明实施例9的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的粒径-存储时间图。
[0030] 图7为本发明实施例10的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的体外释放试验图。
[0031 ]图8为本发明实施例11的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的细胞毒性图。
[0032]图9为本发明实施例12的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的细胞摄取图。
[0033]图10为本发明实施例13的小分子前药自组装纳米粒的血药浓度-时间曲线图。 [0034]图11为本发明实施例14的PEG化的小分子前药自组装纳米粒的组织分布图。
[0035] 图12为本发明实施例15的PEG化的小分子前药自组装纳米粒的在体抗肿瘤实验肿 瘤体积变化图。
[0036] 图13为本发明实施例15的PEG化的小分子前药自组装纳米粒的在体抗肿瘤实验裸 鼠体重变化图。
【具体实施方式】
[0037] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施 例范围之中。
[0038] 实施例1:酯键相连的紫杉醇-油酸前药(ΡΤΧ-0Α)的合成
[0039] 油酸(0A)溶于少量二氯甲烷中，在DCC和DMAP的催化作用下，在犯保护下，冰浴2-4h，然后与紫杉醇在25°CN2保护下反应24-48h，经分离纯化得到白色粉末前药。采用核磁共 振测定h-NMR氢谱来确定实施例1中前药的结构，选用的溶剂为CDC13，结果如图1，波谱解析 结果如下：
[0040] 咕-匪1?(4001抱，0)(：13)3:8.13(七，2!〇,7.74((1，2!〇,7·61(ι?，lH)，7.59(m，3H)，7.42 (d，4H)，7.40(m，3H)，6.87((1, lH，J = 9.2Hz，-NH_)，6.29(t，2H，10-H，13-H)，5.95(dd，lH，J = 3.2Hz ,J = 6.0Hz,3,-H) ,5.69(d,lH ,J = 7.2Hz,2-H) ,5.50(d,lH ,J = 3.2Hz,2,-H),5.34 (m,2H,-CH=CH-),4.98(d,lH ,J = 8.0Hz,5-H),4.45(t,lH,7-H),4.31(d,lH ,J = 8.4Hz,20 a-H),4.21(d,lH,J = 8.4Hz,2O0-H) ,3.83(d,lH,J = 6.8Hz,3-H) ,2.52-2.64(m,lH,6a-H), 2.46(s,3H,4-C0CH3) ,2.39(m,2H,14a-H,14g-H) ,2.35(t,2H,J = 7.5Hz,-CH2C0-) ,2.23(s, 3H,10-C0CH3),2.00(s,4H,-CH2CH=CHCH2-),1.95(s,3H,18-H),1.89(t,lH,6g-H),1.68(s, 3H,19-H),1.58(t,2H,-CH 2CH2C0-),1.23(t,23H,17-H) ,1.13(s,3H,16~H) ,0.88(t,3H,J = 6.4Hz,-CH3)〇
[0041] 实施例2:氧化还原双敏感的单硫醚键相连的紫杉醇-油酸前药(PTX-S-OA)的合成 [0042]将乙二醇置于50mL三颈瓶中，向茄形瓶中加入适量对甲苯磺酸，N 2保护，加热到 100-120°C，将用适量甲苯溶解的油酸溶液缓慢滴注到反应瓶中，反应2-4h。反应结束后，静 置分层，用甲苯萃取至乙二醇层TLC无产物点，合并甲苯层，然后用饱和NaHC0 3溶液洗至中 性，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干，经分离纯化得(Z)-油酸-2-羟乙基酯。将适量的2,2'_硫代 二乙酸酐和少量的三乙胺置于25mL茄形瓶中，加入10-15mLCH 2Cl2,加入HOBt和EDCI，N2保护 条件降温到〇°C下，缓慢滴加溶解在CH 2C12的（Z)-油酸-2-羟乙基酯，搅拌0.5-lh，室温过夜 反应。反应结束后，蒸干，稀盐酸酸化，CH 2C12萃取至水层TLC无产物点，饱和NaCl溶液洗 CH2C12层三次，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干，经分离纯化得(2-氧代-2-(2-((Z)_油酰氧基） 乙氧基）乙硫基）乙酸。将（2-氧代-2-(2-((Z)_油酰氧基）乙氧基）乙硫基）乙酸、EDCI、H0Bt 和紫杉醇置于10mL茄形瓶中，加入3-5mL CH2C12，N2保护条件降温到0°C下，搅拌0.5-lh，室 温过夜反应。反应结束后，饱和NaCl溶液洗CH 2C12层三次，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干，经分 离纯化得白色固体。
[0043] 采用核磁共振测定1H-NMR氢谱来确定实施例2中前药的结构，选用的溶剂为CDC13， 结果如图2,波谱解析结果如下：
[0044] 4-^^(40010^,00(:13)3:8.15(12^ = 8.5?)，7.77(q，2H，J = 7.3Hz)，7·62(ι?， lH)，7.52(m，3H)，7.42(d，4H)，7.40(s，lH)，7.37(d，2H)，6.30(s，lH，10-H)，6.26(s，lH，13-H) ,6.06(dd,lH ,J = 3.2Hz ,J = 6.4Hz,3,-H) ,5.70(d,lH ,J = 7.1Hz,2-H) ,5.50(d,lH ,J = 3.1Hz，2'-H)，5.33-5.34(m，2H，-CH = CH-)，4.79(d，lH，J = 2.4Hz，5-H)，4.43(q，lH，7-H), 4.30(d,lH ,J = 6.0Hz,20a-H) ,4.26~4.29(m,4H,-〇CH2CH2〇-) ,4.25(d, 1H, J= 10.8Hz , 20g-H),3.83(d,lH ,J = 7Hz,3-H),3.17-3.53(m,4H,-CH2-S-CH2-),2.51-2.60(m,lH,6a-H),2.48 (s,3H,4-C0CH 3) ,2.33(m,2H,14a-H,14g-H),2.28(t,2H,J = 7.5Hz,-CH2C0-),2.23(s,3H, 10-COCHs), 2.01 (s, H4, J = 7.5Hz , ~CH2CH=CHCH2~, CH3CN), 1.95(d, 3H, 18~H), 1.89 (t, 1H, 6 g-H) ,1.69(s,3H,19~H) ,1.62(dd,2H,J = 7.2Hz,J = 8.4Hz,-CH2CH2C0-) ,1.26(t,25H,17~ H)，1.14(s，3H，16-H)，0.88(t，3H，J = 6.7Hz，-CH3)。
[0045] 实施例3:氧化还原双敏感的间隔二硫醚键相连的紫杉醇-油酸前药(PTX-2S-0A) 的合成
[0046]将乙二醇置于50mL三颈瓶中，向茄形瓶中加入适量对甲苯磺酸，N2保护，加热到 100-120°C，将用适量甲苯溶解的油酸溶液缓慢滴注到反应瓶中，反应2-4h。反应结束后，静 置分层，用甲苯萃取至乙二醇层TLC无产物点，合并甲苯层，然后用饱和NaHC0 3溶液洗至中 性，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干，经分离纯化得(Z)-油酸-2-羟乙基酯。将适量的1，2-亚乙 基二硫代二乙酸酐和少量的三乙胺置于25mL茄形瓶中，加入10-15mL CH2C12,加入HOBt和 EDCI，犯保护条件降温到0°C下，缓慢滴加溶解在012(：12的（Z)-油酸-2-羟乙基酯，搅拌0.5-lh，室温过夜反应。反应结束后，蒸干，稀盐酸酸化，CH 2C12萃取至水层TLC无产物点，饱和 NaCl溶液洗CH2C12层三次，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干，经分离纯化得(2-( 2-氧代-2-( 2-((Z)-油酰氧基）乙氧基）乙硫基）乙硫基）乙酸。将（2-(2-氧代-2-(2-( (Z)-油酰氧基）乙氧 基）乙硫基）乙硫基）乙酸、EDCI、H0Bt和紫杉醇置于10mL茄形瓶中，加入3-5mL CH2C12，N2保 护条件降温到0 °C下，搅拌0.5-lh，室温过夜反应。反应结束后，饱和NaCl溶液洗CH2C12层三 次，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干，经分离纯化得白色固体。
[0047] 采用核磁共振测定1H-NMR氢谱来确定实施例3中前药的结构，选用的溶剂为CDC13， 结果如图3,波谱解析结果如下：
[0048] 4-^^(40010^,00(:13)3:8.14((1,2^ = 7.2?)，7.74(d，2H，J = 8.5Hz)，7.61(t， 1H,J = 7.4Hz) ,7.51(q,3H) ,7.35-7.43(m,7H) ,7.08(d,lH,J = 9.2Hz,-NH-) ,6.30(s,lH, 10-H),6.26(d,lH ,J = 8.6Hz,13-H),6.02(dd,lH ,J = 3.0Hz ,J = 6.4Hz,3,-H),5.68(d,lH ,J = 7.0Hz,2-H),5.56(d,lH ,J = 3.1Hz,2,-H),5.32-5.36(m,2H,-CH = CH-),4.99(d,lH ,J = 8.0Hz,5-H),4.45(dd,lH ,J = 6.5Hz ,J = 4.2Hz,7-H) ,4.31 (d, 1H ,J = 8.4Hz , 2〇a-H) ,4.23-4.25(s,4H,-〇CH2CH2〇-) ,4.22(d, 1H ,J = 8.4Hz , 20β-Η), 3.83(d, 1H ,J = 7.0Hz , 3-H), 3.33 (s,2H,-⑶CH2-S-CH2CH2-S-CH2CO-) ,3.16(d,2H,J=1.7Hz,-COCH2-S-CH2CH2-S-CH2CO-), 2.79(d,4H,J = 4.6Hz,-S-CH2CH2-S-) ,2.52-2.60(m,lH,6a-H),2.46(s,3H,4-C0CH3),2.38 (q,lH,14a-H),2.31(t,2H,J = 7.3Hz,-CH2C0-),2.23(s,3H,10-C0CH3) ,2.00(m,4H,-CH2CH = CHCH2~) , 1,94(s,3H,18-H),1.89(t,lH,60-H),1.94(s,6H,19-H),1.60(t,4H,-CH2CH 2C0-),1.24-1.29(m,25H,17-H),1.14(s,3H,16-H),0.88(t,3H,J=6.8Hz,-CH3)〇
[0049] 实施例4:还原敏感的二硫键键相连的紫杉醇-油酸前药(PTX-S-S-0A)的合成
[0050] 将乙二醇置于50mL三颈瓶中，向茄形瓶中加入适量对甲苯磺酸，N2保护，加热到 100-120°C，将用适量甲苯溶解的油酸溶液缓慢滴注到反应瓶中，反应2-4h。反应结束后，静 置分层，用甲苯萃取至乙二醇层TLC无产物点，合并甲苯层，然后用饱和NaHC0 3溶液洗至中 性，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干，经分离纯化得(Z)-油酸-2-羟乙基酯。将适量的2,2'_二硫 代二乙酸酐置于25mL茄形瓶中，加入10-15mL CH2C12,加入H0Bt、EDCI和DMAP作为催化剂，N2 保护条件降温到〇°C下，缓慢滴加用CH2C12溶解的（Z)-油酸-2-羟乙基酯，搅拌0.5-lh，室温 过夜反应。反应结束后，蒸干，稀盐酸酸化，CH 2C12萃取，饱和NaCl溶液洗CH2C12层三次，无水 硫酸钠干燥，过滤，蒸干，经分离纯化得(2-氧代-2-(2-( (Z)-油酰氧基）乙氧基）乙二硫基） 乙酸。将（2-氧代-2-(2-( (Z)-油酰氧基）乙氧基）乙二硫基）乙酸、EDCI、H0Bt和紫杉醇置于 10mL茄形瓶中，加入3-5mL CH2C12，N2保护条件降温到0°C下，搅拌0.5-lh，室温过夜反应。反 应结束后，饱和NaCl溶液洗CH 2C12层三次，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干，经分离纯化得白色 固体。
[0051] 采用核磁共振测定1H-NMR氢谱来确定实施例4中前药的结构，选用的溶剂为CDC13， 结果如图4,波谱解析结果如下：
[0052] 4-^^(40010^,00(:13)3:8.14((1,2^ = 7.2?)，7.76(d，2H，J = 8.8Hz)，7·62(ι?， lH)，7.52(m，3H)，7.33-7.43(m，7H)，6.99(s，lH，-NH-)，6.30(s，lH，10-H)，6.25(m，lH，13-H)，6.02((1, lH，J = 8.4Hz，3'-H)，5.69(d，lH，J = 7.2Hz，2-H)，5.52(s，lH，2'-H)，5.34(s， 2H，-CH = CH-)，4.96(d，lH，J = 9.6Hz，5-H)，4.44(q，lH，7-H)，4.31(d，lH，J = 8.8Hz，20a-H) ,4.27(d,4H,J = 6.4Hz,-QCH2CH2〇-) ,4.22(d,lH,J = 9.2Hz,20g~H) ,3.82(d,lH,J = 7.6Hz,3-H),3.65(s,2H, -S-SCH2CO-PTX ),3.49(s,2H, -COCH2-S-S-CH2CO-PTX ),2.56(m,lH, 6a~H) ,2.45(s,3H,4-C0CH3) ,2.30(t,2H,J = 6.4Hz,-CH2C0-) ,2.17(s,3H,10-C0CH3),2.01 (d,4H,-CH2CH = CHCH2-) ,1.94(s,3H,18~H) ,1.69(s,3H,19~H) ,1.55(s,26H,-CH2CH2C0-, H2〇),1.26(d,23H,17-H),1.14(s,3H,16-H),0.88(s,3H,-CH3)〇
[0053] 实施例5:非PEG化的小分子前药自组装纳米粒的制备
[0054]精密称取前药8mg，用lmL乙醇将其溶解，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到4mL去 离子水中，自发形成均匀的纳米粒(ΡΤΧ-0Α纳米粒，PTX-S-0A纳米粒，PTX-2S-0A纳米粒， PTX-S-S-0A 纳米粒)。
[0055]实施例6: PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的制备
[0056] 精密称取TPGS2k 1.4mg和前药8mg，用lmL乙醇将其溶解，搅拌下，将该乙醇溶液缓 缓滴加到4mL去离子水中，自发形成均匀的纳米粒(PTX-〇A/TPGS2k纳米粒，PTX-S-〇A/TPGS 2k 纳米粒，PTX-2S-0A/TPGS2k纳米粒，PTX-S-S-〇A/TPGS2k纳米粒）。
[0057]通过透射电子显微镜测定实施例6中制备的小分子前药自组装纳米粒的粒径和形 态，结果如图5,透射电镜图表明载药纳米粒为均一的球形，粒径在100nm左右。
[0058]实施例7:包载香豆素-6或DiR的小分子前药自组装纳米粒的制备
[0059] 精密称取TPGS2k 1.4mg、香豆素-6 0.8yg或DiR 0.8mg和前药8mg，用lmL乙醇将其 溶解，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到4mL去离子水中，自发形成均匀的纳米粒。
[0060]实施例8:主动靶向的小分子前药自组装纳米粒的制备
[0061 ] 精密称取TPGS2k 0.7mg、DSPE-PEG-AA 0.7mg和前药8mg，用lmL乙醇将其溶解，搅拌 下，将该乙醇溶液缓缓滴加到4mL去离子水中，自发形成均匀的纳米粒。
[0062]实施例9 :PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的胶体稳定性试验 [0063] 将实施例6中制备的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒PTX-〇A/TPGS 2k纳米粒， PTX-S-〇A/TPGS2k 纳米粒，PTX-2S-0A/TPGS2k 纳米粒，和 PTX-S-S-〇A/TPGS2k 纳米粒（2 · Omg/ mL)在4°C条件下储存3个月。在此期间，通过动态光散射测定其粒径变化。结果如图6所示， PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒在三个月内粒径无明显变化，显示出良好的长期储存 稳定性。
[0064]实施例10 :PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的体外释放试验 [0065]以含乙醇的pH 7.4磷酸盐缓冲液为释放介质，考察PEG修饰的小分子前药自组装 纳米粒的体外释放情况。将实施例6中制备的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒(紫杉醇 含量为200mg)加入到30mL释放介质中，在37°C条件下，于设定的时间点取样，通过高效液相 色谱测定紫杉醇浓度。向释放介质中加入一定浓度的双氧水(H 2〇2)或二硫苏糖醇(DTT)，以 分别考察纳米粒在氧化条件和还原条件下的释放情况。
[0066]结果如图7所示，酯键相连的紫杉醇-油酸前药(PTX-0A)具有极高的稳定性，无论 是否存在H2〇2和DTT，PTX-〇A/TPGS2k纳米粒几乎不发生水解，PTX很难从前药上释放出来。相 比之下，PTX-S-0A，PTX-2S-0A和PTX-S-S-0A具有一定程度的氧化或还原敏感性。当释放介 质中含有一定浓度的DTT时，PTX-S-S-〇A/TPGS 2k纳米粒在2小时内释放了超过90 %的PTX， PTX-S-〇A/TPGS2k纳米粒在48小时内释放了 50 %的PTX，PTX-2S-0A/TPGS2k纳米粒在48小时 之内只释放了 26% 的 PTX。各前药还原敏感性:PTX-S-S-0A>PTX-S-0A>PTX-2S-0A>PTX-0A。 同时，PTX-S-0A，PTX-2S-0A还具有一定程度的氧化敏感性。当释放介质中含有一定浓度的 H2〇2时，PTX-S-0A在6小时内释放了超过90 %的PTX，PTX-2S-0A/TPGS2k纳米粒在12小时释放 出46%的PTX。实验结果表明本发明设计的系列紫杉醇-油酸小分子前药具有氧化还原敏感 释药的特性，能对肿瘤部位特异的氧化还原环境作出响应，实现肿瘤部位特异性释药，有望 提高紫杉醇的抗肿瘤效果并降低对机体的毒副作用。
[0067]实施例11 :PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的细胞毒性 [0068]采用MTT法考察PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒对人鳞状上皮癌细胞(KB-3-1)，人大细胞肺癌细胞(H460)和人卵巢癌细胞(0VCAR-8)的细胞毒性。将状态良好的细胞消 化，用培养液稀释至5000cell S/mL细胞密度，吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液100yL， 置培养箱中孵育24h使其贴壁。待细胞贴壁后加泰素或实施例6中制备的PTX-S-〇A/TPGS 2k纳 米粒，PTX-2S-0A/TPGS2k 纳米粒，PTX-S-S-〇A/TPGS2k 纳米粒和 PTX-〇A/TPGS2k 纳米粒。本实验 中药物溶液与纳米粒制剂的配制和稀释均用1640培养液，并用0.22μπι滤膜无菌过滤。受试 溶液每孔加入l〇〇yL，每个浓度3个平行孔。对照组，即不加待测药液，单一补加100yL培养 液，置培养箱中和细胞共同孵育。于加药后48和72h，将96孔板取出，每孔加入5mg/mL MTT溶 液20yL，置培养箱中孵育4h后甩板，将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体后，每孔加入 200yL DMS0于振荡器上振荡10min以溶解蓝紫色结晶物。设定A1孔（只含有200yL DMS0)为 调零孔。使用酶标仪在570nm处测定各孔调零后的吸光度值。
[0069] MTT结果如图8所示，与泰素相比，小分子前药自组装纳米粒的体外细胞毒性均存 在一定程度的降低。不同小分子前药自组装纳米粒毒性大小为PTX-S-S-〇A/TPGS2km米粒〉 PTX-S-〇A/TPGS2k 纳米粒〉PTX-2S-0A/TPGS2k 纳米粒〉PTX-〇A/TPGS2k 纳米粒。PTX-〇A/TPGS2k 纳 米粒几乎没有细胞毒性。实验结果表明，前药的细胞毒性与PTX从前药中的释药的难易程度 相关，连接臂对肿瘤部位氧化还原环境的敏感程度越高，紫杉醇越容易从前药中释放出来， 细胞毒性就越大。本发明设计的系列紫杉醇-油酸小分子前药能对肿瘤部位特异的氧化还 原环境作出响应，实现肿瘤部位特异性释药，提高紫杉醇的抗肿瘤效果并降低对机体的毒 副作用。
[0070]实施例12 :PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的细胞摄取 [0071]采用流式细胞仪测定PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒在鳞状上皮癌细胞(KB-3-1)摄取情况。将KB-3-1细胞以5000 cells/mL的密度接种到12孔板上，置培养箱中孵育 24h使其贴壁。待细胞贴壁后加香豆素-6溶液或实施例7中制备的香豆素-6-PTX-S-0A/ TPGS2k纳米粒，香豆素-6-PTX-2S-0A/TPGS2k纳米粒，香豆素-6-PTX-S-S-0A/TPGS 2k纳米粒和 香豆素-6_PTX-0A/TPGS2k纳米粒）。本实验中药物溶液与纳米粒制剂的配制和稀释均用1640 培养液，并用〇 . 22μηι的滤膜无菌过滤，香豆素-6的浓度为200ng/mL。在37°C孵化0.5h或2h 后，将细胞清洗，收集并分散在PBS中，用流式细胞仪考察细胞对香豆素-6的摄取情况。 [0072]结果如图9所示，香豆素-6溶液和香豆素-6标记的纳米粒的细胞摄取都具有时间 依赖性，随着孵化时间的延长，细胞摄取量明显增加。同时，相对于香豆素-6溶液，香豆素-6 标记的纳米粒具有更高的荧光强度，说明纳米粒能显著增加细胞对药物的摄取。此外，不同 纳米粒之间也存在摄取差异:PTX-S-S-〇A/TPGS 2k纳米粒〉PTX-S-〇A/TPGS2k纳米粒〉PTX-2S-0A/TPGS2k纳米粒〉PTX-〇A/TPGS 2k纳米粒。PTX-S-S-〇A/TPGS2k纳米粒的体外释药速率最快， 同时又具有最高的细胞摄取，表明从纳米粒中水解释放出的PTX会影响细胞的状态，增加细 胞对纳米粒的吸收。
[0073]实施例13:小分子前药自组装纳米粒的药代动力学研究
[0074]取54只健康、雄性大鼠，体重200-250g，随机分为9组，给药前禁食12h，自由饮水。 分别静脉注射紫杉醇溶液剂(泰素），实施例5中制备的非PEG化的小分子前药自组装纳米粒 (PTX-2S-0A纳米粒，PTX-S-0A纳米粒，PTX-S-S-0A纳米粒，ΡΤΧ-0Α纳米粒)和实施例6中制备 的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒(PTX-2S-0A/TPGS 2k纳米粒，PTX-〇A/TPGS2k纳米粒， PTX-S-S-〇A/TPGS2k纳米粒，PTX-S-〇A/TPGS2k纳米粒）。紫杉醇的剂量为5mg/kg。于规定的时 间点眼眶取血，分离获得血浆。通过液相色谱-质谱联用仪测定血浆中的药物浓度。
[0075] 结果如图10,非PEG化的小分子前药自组装纳米粒体循环时间非常短，生物利用度 非常低。可能是因为非PEG化的小分子前药自组装纳米粒稳定性差，且表面疏水，易被网状 内皮系统吞噬。相比之下，PEG化的小分子前药自组装纳米粒循环时间明显延长，生物利用 度明显提高。其中，由于ΡΤΧ-0Α前药的高度稳定性，PTX-〇A/TPGS 21^米粒的生物利用度最 高。不同PEG化的小分子前药自组装纳米粒生物利用度的大小为:PTX-〇A/TPGS 2km米粒〉 PTX-2S-0A/TPGS2k 纳米粒〉PTX-S-〇A/TPGS2k 纳米粒〉PTX-S-S-〇A/TPGS2k 纳米粒。实验结果表 明，PEG化的小分子前药自组装纳米粒能显著延长紫杉醇在血液中的循环时间。
[0076] 实施例14:小分子前药自组装纳米粒的组织分布实验
[0077]将人口腔上皮癌细胞悬液(KB-3-1)接种于裸鼠，当肿瘤体积达到500mm3时，尾静 脉注射给药:DiR溶液和实施例7中制备的DiR-PTX-〇A/TPGS2k纳米粒，DiR-PTX-S-〇A/TPGS 2k 纳米粒，DiR-PTX-2S-0A/TPGS2k纳米粒和DiR-PTX-S-S-〇A/TPGS2k纳米粒。DiR的给药剂量为 lmg/kgj小时或24小时后，将裸鼠处死，分离出主要器官（心，肝，脾，肺，肾）和肿瘤，用活体 成像仪进行分析。
[0078] 结果如图11所示，与DiR溶液组相比，PEG化的小分子前药自组装纳米粒组在肿瘤 组织的荧光强度显著增加。同时，DiR溶液组中荧光主要分布在肺部，在肿瘤组织中几乎没 有分布。相比之下，PEG化的小分子前药自组装纳米粒主要分布在肝脏和肿瘤组织。说明PEG 化的小分子前药自组装纳米粒能增加药物在肿瘤部位的积蓄，减少药物在非肿瘤部位的分 布，在提高药效的同时降低紫杉醇对机体的毒副作用。
[0079] 实施例15 :PEG化的小分子前药自组装纳米粒的在体抗肿瘤实验
[0080] 将人鳞状上皮癌细胞悬液(KB-3-1，lxl06cells/100yL)接种于雌性裸鼠腹侧皮 下。待肿瘤体积生长至l〇〇-120mm 3,将荷瘤小鼠随机分为六组，每组五只：空白对照组 (PBS)，泰素组，PTX-〇A/TPGS2k 纳米粒组，PTX-2S-0A/TPGS2k 纳米粒组，PTX-S-〇A/TPGS2k 纳米 粒组和PTX-S-S-〇A/TPGS2k纳米粒组。给药所用的纳米粒为实施例6中制备的PEG修饰的小分 子前药自组装纳米粒。每隔Id给药1次，连续给药5次，按紫杉醇计算，给药剂量为8mg/kg。给 药后，每天观察小鼠的存活状态，称体重，测量肿瘤体积。最后一次给药后一天将裸鼠处死， 获取器官和肿瘤，进行进一步分析评价。
[0081 ] 结果如图12所示，在空白对照组和PTX-〇A/TPGS2k纳米粒组中，肿瘤体积迅速增长， 在第10天达到1100-1300mm3。相比之下，PTX-2S-0A/TPGS2k纳米粒和泰素能延缓肿瘤生长， 而PTX-S-〇A/TPGS 2k纳米粒和PTX-S-S-〇A/TPGS2k纳米粒组则能明显抑制肿瘤生长。给药10 天以后，PTX-S-〇A/TPGS 2k纳米粒组的肿瘤体积仅为150mm3左右，而PTX-S-S-〇A/TPGS2k纳米 粒的肿瘤几乎全部看不见了。抗肿瘤效果与体外释放结果和细胞毒性结果保持一致，连接 臂对肿瘤部位氧化还原条件的敏感程度越高，紫杉醇越容易实现肿瘤部位特异性释药，相 应的抗肿瘤效果越好。
[0082] 如图13所示，各组裸鼠体重没有明显变化。结果说明这些PEG化的小分子前药自组 装纳米粒在具有明显的抗肿瘤效果的同时，没有对机体造成显著的非特异性毒性，是安全 有效的抗癌药物传递系统。
【主权项】
1. 紫杉醇-油酸小分子前药，其特征在于，紫杉醇和油酸直接通过醋键相连，或通过肿 瘤环境敏感键相连，包括(a)醋键、（b)氧化还原双敏感的单硫酸键、（C)氧化还原双敏感的 间隔二硫酸键W及(d)还原敏感的二硫键，其结构式为：2. 根据权利要求1所述的紫杉醇-油酸小分子前药，其特征在于，所述的紫杉醇可W为 紫衫烧类化合物。3. 根据权利要求1所述的紫杉醇-油酸小分子前药，其特征在于，油酸可W用硬脂酸、反 式油酸、亚油酸、α-亚麻酸、丫-亚麻酸、二十二碳六締酸、花生四締酸替换。4. 根据权利要求1所述的紫杉醇-油酸小分子前药，其特征在于，所述的肿瘤环境敏感 键为抑敏感键或还原环境敏感键，所述的抑敏感键为腺键、碳酸醋键，所述的还原环境敏感 键为单硫酸键、二硫酸键、二硫键或金属蛋白酶敏感键。5. 如权利要求1所述的紫杉醇-油酸小分子前药的合成方法，其特征在于，采用如下步 骤制备： (1) 醋键相连的紫杉醇-油酸前药的合成：油酸在DCC和DMAP的催化下，与紫杉醇在化保 护下反应，分离纯化即得； (2) 氧化还原双敏感的单硫酸键相连的紫杉醇-油酸前药的合成：油酸在对甲苯横酸催 化下，与乙二醇反应，得油酸-乙二醇醋，油酸-乙二醇醋在册化和邸CI的催化下，与2,2'-硫 代二乙酸酢反应，得(2-氧代-2-(2-( (Ζ)-油酷氧基）乙氧基）乙硫基）乙酸，（2-氧代-2-(2- ((Z)-油酷氧基）乙氧基）乙硫基）乙酸在册化和抓CI的催化下，与紫杉醇反应，分离纯化即 得，反应全程都在化保护下进行； (3) 氧化还原双敏感的间隔二硫酸键相连的紫杉醇-油酸前药的合成：油酸在对甲苯横 酸催化下，与乙二醇反应，得油酸-乙二醇醋，油酸-乙二醇醋在册化和抓CI的催化下，与1， 2-亚乙基二硫代二乙酸酢反应，得(2-(2-氧代-2-(2-((Z)-油酷氧基）乙氧基）乙硫基）乙硫 基）乙酸，（2-(2-氧代-2-(2-((Z)-油酷氧基）乙氧基）乙硫基）乙硫基）乙酸在册化和邸Cl的 催化下，与紫杉醇反应，分离纯化即得，反应全程都在化保护下进行； (4)还原敏感的二硫键相连的紫杉醇-油酸前药的合成：油酸在对甲苯横酸催化下，与 乙二醇反应，得油酸-乙二醇醋，油酸-乙二醇醋在册化、EDCI和DMAP的催化下，与2，2 二硫 代二乙酸酢反应，得（2-氧代-2-(2-( (Z)-油酷氧基）乙氧基）乙二硫基）乙酸，（2-氧代-2- (2-((Z)-油酷氧基）乙氧基）乙二硫基）乙酸在册化和抓CI的催化下，与紫杉醇反应，分离纯 化即得，反应全程都在化保护下进行。6. 紫杉醇-油酸小分子前药自组装纳米粒，其特征在于，所述的紫杉醇-油酸小分子前 药在水中自组装形成前药纳米粒，其制备过程如下： 将一定量的紫杉醇-油酸小分子前药溶解到适量的乙醇中，揽拌下，将该乙醇溶液缓缓 滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。7. 根据权利要求6所述的小分子前药自组装纳米粒，其特征在于，所述的紫杉醇-油酸 小分子前药纳米粒为非PEG化的小分子前药纳米粒、PEG修饰的小分子前药纳米粒、包载或 药物的小分子前药纳米粒和主动祀向的小分子前药纳米粒。8. 根据权利要求7所述的小分子前药自组装纳米粒，其特征在于，所述的PEG为TPGS2k、 DS阳-PEG和PEG-PE，所述的疏水性巧光物质为香豆素-6、罗丹明、DiR、Di I、Cy-5和Cy-7。9. 权利要求1-5任何一项所述的紫杉醇-油酸小分子前药或权利要求6-8任何一项所述 的小分子前药自组装纳米粒在药物传递系统中的应用。10. 权利要求1-5任何一项所述的紫杉醇-油酸小分子前药或权利要求6-8任何一项所 述的小分子前药自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。11. 权利要求1-5任何一项所述的紫杉醇-油酸小分子前药或权利要求6-8任何一项所 述的小分子前药自组装纳米粒在注射给药、口服给药或局部给药药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK105833284SQ201610206408
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月31日
【发明人】孙进, 罗聪, 何仲贵, 孙丙军, 刘丹
【申请人】沈阳药科大学