紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统及其制备方法，所述的紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统主要包括紫杉醇和Soluplus，为液态分散制剂形式或为冻干制剂形式；本发明以双亲性高分子材料Soluplus为载体，采用注入法制备载紫杉醇的自组装聚合物纳米粒，较溶液剂提高了细胞的摄取率并降低了毒副作用。
【专利说明】紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统及其制备方法 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种新型的紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统及其制备方法。 (二)【背景技术】
[0002] 紫杉醇为红豆杉树皮中提取得到的一种广谱高效抗癌药物，主要用于卵巢癌、乳 腺癌、小细胞肺癌、前列腺癌、头颈癌、食管癌、精原细胞瘤、复发非何金氏淋己瘤等的治疗。 紫杉醇水中的溶解度极低（约0.化g/mU;及严重的毒副作用限制了其临床应用。为提高其 水溶性，主要的措施有：紫杉醇表面亲水性化学修饰（Gund M,趾anna A,Dubash N,Damre A,Singh KS,Satyam A.Water-soluble prodrugs of paclitaxel containing self- immolative disulfide linkers.Bioorg Med Chem Lett. 2015,25(1): 122-127);制成适 宜的给药系统:如市售制剂紫杉醇注射液(Taxol?，泰素，6mg/ml)、注射用脂质体(力拌素?)、 注射用紫杉醇（白蛋白结合型，Abraxane?)及注射用紫杉醇胶束（Genexol-PMB'）。其中紫杉醇 注射液为聚氧乙締藍麻油和乙醇(50:50，v/v)配制的增溶体系，浓度5mg/ml，但聚氧乙締藍 麻油毒性大，易导致过敏、溶血、肾毒性及神经毒性等。注射用脂质体（力扑素 g)为第一代脂 质体，由大豆憐脂、胆固醇和Tween 80组成，同样具有过敏等副作用。注射用紫杉醇聚合物 胶束(Genexi，l-PVr，）WPEG-PLA为载体，粒径20~50nm的聚合物胶束，较紫杉醇注射液提高 了药物在肿瘤部位的分布。注射用紫杉醇（白蛋白结合型KAbraxane?)为白蛋白稳定的紫杉 醇纳米混悬体系，平均粒径约130nm，每支lOOmg，临用前配制成5mg/ml混悬剂iv滴注，较紫 杉醇注射液降低了毒副作用，提高剂量，增强抗癌疗效。此外，尚有PEG修饰紫杉醇、紫杉醇 长循环、阳离子、主动祀向脂质体、环糊精包合物、微球等研究报导。
[0003] 聚乙締己内酷胺-聚乙酸乙締醋-聚乙二醇接枝共聚物（商品名Soluplus)为N-乙 締基-ε-己内酷胺-乙酸乙締醋-聚乙二醇（57 :30 :13)共聚而成，分子量为90，000~140， OOOg/mol，是BASF公司2009年研发上市的一种新型高分子材料。已有采用热烙挤出法制备 口服环抱素超饱和聚合物胶束（化 H,Xia D,Zhu Q,Zhu C,Qien D,Gan Y.Supersa1:urated polymeric micelles for oral cyclosporine A delivery.Eur J Pharm Biopharm, 2013,85(3 Pt B) :1325-36),薄膜分散-FI27水化法制备口服搬皮素和大黄素聚合物胶束 (Dian L,Yu E,Chen X,Wen X,Zhang Z,Qin L,Wang Q,Li G,Wu C.Enhancing oral bioavailability of quercetin using novel soluplus polymeric micelies.化noscale Res Lett,2014,9(1) :2406.;典灵辉，于恩江，程纪伦，郭向华，黄紫 荣，张振声.大黄素 Soluplus聚合物胶束的制备及质量评价.中国实验方剂学杂志，2014，20 (16): 15-18.)，将难溶性药物Sapaci化bine与Soluplus配制成增溶的溶液剂可提高该药的 抗癌疗效，但该药在Sol叫lus中的药物浓度极低，最大仅49.6μg/ml(Obata T,Suzuki Y, Ogawa NjKurimoto I,Yamamoto H,Furuno T,Sasaki T,Tanaka M.Improvement of the 曰ntitumor 曰ctivity of poorly soluble s曰p曰cit曰bine(CS-682)by usingS舰p虹s,疫曰s 曰 surfactant.Biol Pharm Bull.2014;37(5):802-7.)。 (Ξ)
【发明内容】
[0004] 本发明旨在WSoluplus为载体，提供一种注入法，制备新型的紫杉醇自组装聚合 物纳米粒给药系统，用于癌症的治疗。与市售注射剂相比，本发明给药系统中不含有聚氧乙 締藍麻油。与已有的研究不同的是，本发明发现Soluplus形成的载体为自组装聚合物纳米 粒，且制备方法为注入法，与现有报道的Soluplus聚合物胶束方法不同。
[0005] 本发明所提供的新型紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统，包载稳定性良好，可 直接W液态分散制剂或冻干粉针制剂形式，促进了细胞对紫杉醇的摄取，并降低了紫杉醇 毒副作用。
[0006] 本发明采用如下技术方案：
[0007] -种紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统，主要包括紫杉醇和Soluplus ;基于所 述的紫杉醇和Soluplus，所述紫杉醇的重量百分数为0.1 %~15%，所述Soluplus的重量百 分数为99.9 %~85 %;
[000引优选的，基于所述的紫杉醇和Soluplus,所述紫杉醇的重量百分数为1 %~ 12.5%，所述Soluplus的重量百分数为99%~82.5% ;
[0009] 更加优选的，基于所述的紫杉醇和Sol叫lus，所述紫杉醇的重量百分数为5%~ 10%，所述Soluplus的重量百分数为95%~90% ;
[0010] 本发明所述的紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统为液态分散制剂形式或为冻 干制剂形式。
[0011] 具体的，当所述紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统为液态分散制剂形式时，由 紫杉醇、Soluplus、水相组成;基于所述的紫杉醇和Soluplus,所述紫杉醇的重量百分数为 0.1 %~15 %，所述Soluplus的重量百分数为99.9 %~85 %，所述水相的体积量为5~ 200mL/g Soluplus；
[0012] 优选的，基于所述的紫杉醇和Soluplus,所述紫杉醇的重量百分数为1 %~ 12.5%，所述Soluplus的重量百分数为99%~82.5% ;
[0013] 更加优选的，基于所述的紫杉醇和Sol叫lus，所述紫杉醇的重量百分数为5%~ 10%，所述Soluplus的重量百分数为95%~90% ;
[0014]优选所述水相的体积量为10~1 OOmL/g Soluplus;更加优选所述水相的体积量为 15~50mL/g Soluplus。
[0015] 所述的水相由抑调节剂溶于水中配制而成，或者不含抑调节剂，直接为水;所述的 水为纯水、注射用水或灭菌注射用水，优选灭菌注射用水;所述水相的抑值为3.0~9.0,优 选4.0~7.6;
[0016] 所述的抑调节剂为憐酸二氨钢、憐酸二氨钟、憐酸氨二钢、憐酸氨二钟、氨氧化钢、 盐酸、巧樣酸、酒石酸中的至少一种，优选憐酸二氨钢、氨氧化钢或盐酸。
[0017] 本发明还提供了液态分散制剂形式的紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统的制 备方法，所述的制备方法为：
[0018] 将紫杉醇和Soluplus溶于有机溶剂中，得到混合液，揽拌下，将所得混合液注入水 相中，之后除去有机溶剂，无菌过滤，即得液态分散制剂形式的紫杉醇自组装聚合物纳米粒 给药系统；
[0019] 所述水相的体积用量WSoluplus的质量计为5~200mL/g (优选10~100血/g，更优 选15~50mL/g)，所述有机溶剂的体积用量W紫杉醇的质量计为0.014~ImL/mg (优选0.02 ~0.1 mL/mg，更优选0.03~0.05mL/mg)。
[0020] 所述的制备方法通常在0~30°C下操作均可，所述的有机溶剂为：乙醇、甲醇、丙 酬、乙酸乙醋、二甲基甲酯胺、二甲基乙酷胺、二甲基亚讽、二氯甲烧、下醇、戊醇中的一种或 两种W上任意比例的混合溶剂，优选乙醇或丙酬。
[0021] 所述除去有机溶剂的方法可W为本领域常规的减压抽真空法、超滤法、透析法等。 通常，若有机溶剂为二氯甲烧或乙酸乙醋，推荐减压抽真空法，真空度0~〇.〇5MPa;若有机 溶剂为与水互溶的有机溶剂(如:丙酬、乙醇、甲醇、二甲基甲酯胺、二甲基乙酷胺、二甲基亚 讽、下醇或戊醇），推荐超滤法，超滤膜孔径10~50kD。
[0022] 所述的无菌过滤、冷冻干燥均为本领域常用的常规操作方法。
[0023] 在所得液态分散制剂形式的紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统中加入冻干保 护剂并冷冻干燥，即得冻干制剂形式的紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统；
[0024] 所述冻干保护剂的质量用量W所述液态分散制剂形式的紫杉醇自组装聚合物纳 米粒给药系统的体积计为5~250mg/ml，优选10~150mg/ml，更优选50~lOOmg/ml;
[0025] 所述的冻干保护剂为葡萄糖、果糖、乳糖、薦糖、壳聚糖、海藻糖、甘露醇中的一种 或两种W上任意比例的混合物，优选甘露醇。
[0026] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于:本发明W双亲性高分子材料Soluplus 为载体，采用注入法制备载紫杉醇的自组装聚合物纳米粒，较溶液剂提高了细胞的摄取率 并降低了毒副作用。 (四）
【附图说明】
[0027] 图1为实施例1中巧在Soluplus分散液中的发射光谱；
[0028] 图2为实施例2中紫杉醇-Soluplus自组装纳米粒TEM图；
[0029] 图3为实施例4中紫杉醇-Soluplus自组装纳米粒与溶液剂的细胞毒比较(与细胞 作用72h);
[0030] 图4为实施例5中紫杉醇-Soluplus自组装纳米粒与溶液剂的细胞摄取比较。 (五)
【具体实施方式】
[0031] 下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围不 限于此。
[0032] 实施例1: Soluplus自组装纳米粒的结构确证
[0033] 巧是一种介质微极性巧光探针，属于稠环芳控类，室溫下，当巧的浓度小于10- Sfliol/L时，巧溶液在335nm处激发后，分别在373、379、384、394及48化111出现5个巧光发射电 子振动峰。第一个电子振动峰373nm与第Ξ个电子振动峰384nm的巧光强度之比Ii/l3与巧分 子所处环境的极性呈很强的相关性。Il/l3愈小，对应环境的极性愈小，即疏水性愈强。通常 认为，Il/l3比值的转折点即为临界胶束浓度。
[0034] 精密称取巧19.62mg，加无水乙醇溶解，并稀释至10ml量瓶，配制成含巧1.962mg/ ml溶液。精密量取该液0.25ml，加乙醇稀释至50ml量瓶，配制成含巧9.81μg/ml溶液。精密量 取该液100μΙ，置于干净干燥的试管中，挥干。分别加入含Soluplus 0、10、50、100、150、200、 300、500、1000、5000、10000μg/ml的分散液，37 °C避光恒溫振荡12h。于F-4600巧光分光光度 计，固定激发波长335皿，激发狭缝5皿，发射狭缝2.5皿，扫描速率240皿/min，350~500皿扫 描，记录发射光谱图，并计算1373/1384。
[00巧]从图1可见，随着Soluplus浓度的增大巧的巧光强度逐渐增大，说明Soluplus对巧 有增溶作用，但I373/I38込比没有出现降低的现象。
[0036]
[0037] 当浓度为5mg/ml时即可有肉眼可见的淡蓝色乳光，通过激光粒度测定仪测得 Soluplus浓度0.01~80mg/ml的范围，平均粒径56nm±5nm。
[0038] 实施例2:紫杉醇-Soluplus自组装纳米粒的制备
[0039]
[0040] 将紫杉醇和Soluplus溶于无水乙醇中，磁力揽拌下，注入注射用水中，揽拌均匀。
[0041] 分别测定自组装纳米粒的粒径、包封率和稀释稳定性。结果显示自组装纳米粒平 均粒径均为95nm左右，较空白纳米粒略增大；包封率均在99 % W上；当Soluplus浓度从 20mg/ml稀释至0.4mg/ml时，几乎没有药物泄漏;但继续稀释，逐渐有药物泄漏，至0.04mg/ ml时泄漏率约35 %。
[0042] 实施例3:紫杉醇-Soluplus自组装纳米粒冻干剂的制备
[0043]
[0044]
[0045] 制备:将紫杉醇和Soluplus溶于无水乙醇中，磁力揽拌下，注入注射用水中，揽拌 均匀；再经超滤膜Biomax 30kD超滤，按纳米混悬剂:新鲜注射用水（1:50)比例超滤除去无 水乙醇;再加入冻干保护剂甘露醇、薦糖或乳糖，冻干保护剂的质量用量分别为注射用水质 量的5%、10%和15%;冷冻干燥，即得紫杉醇-Soluplus自组装纳米粒冻干剂。
[0046] 结果：W甘露醇为冻干保护剂，外观完整，无塌陷。其他冻干保护剂外观存在不同 程度的缺陷;但对再分散和包封率均几乎没有影响。甘露醇用量增大，冻干粉再分散后的粒 径略有增大。故冻干保护剂W5%甘露醇为优。
[0047]实施例4:紫杉醇-Soluplus自组装纳米粒与溶液剂的体外细胞毒比较 [004引 MCF-7乳腺癌细胞或A549肺癌细胞，浓度1 X 105个/mL接种到96孔板，每孔10化L， 37 °C培养箱中培养过夜，至细胞贴壁，吸除培养液。每孔加10化L用含血清培养液稀释的紫 杉醇溶液和紫杉醇自组装纳米粒及相应浓度的空白载体，紫杉醇浓度分别为0.1、1.2、5.9、 11.8和23.50μΜ，每浓度设复孔3个，同时设空白孔(含培养基和MTT但不含细胞），对照孔(含 培养基、ΜΤΤ和细胞但不含药）。于培养箱中培养72h，分别向每孔中加入0.5 %的ΜΤΤ溶液20μ L，37°C培养箱中继续培养4h，小屯、吸除培养液，每孔中加 DMS0 20化L，水平振摇lOmin，酶标 仪570nm和630nm测定吸光度，计算细胞存活率。
[0049] 从图3可见，与紫杉醇溶液组的溶剂化emo地oreEL相比，空白Soluplus自组装纳米 粒不含任何表面活性剂，在紫杉醇浓度为0.1~23.5μΜ范围，与MCF-7或A549细胞共培养 72h，细胞存活率均在90% W上，说明其几乎没有毒副作用。与紫杉醇溶液相比，紫杉醇- Soluplus自组装纳米粒降低了游离药物的毒副作用，提高了使用的安全性。
[0050] 实施例4:紫杉醇-Soluplus自组装纳米粒与溶液剂的体外细胞摄取比较
[0051 ] MCF-7乳腺癌细胞或A549肺癌细胞，浓度2X 105个细胞接种于12孔板中，每孔ImL， 置于37°C培养箱中培养24h，待细胞贴壁生长，吸出培养液，每孔加入浓度58μΜ的紫杉醇- So luplus自组装纳米粒或溶液剂ImL，分别培养1、2、4、化，除去培养液，用4 °C的PBS溶液冲 洗Ξ次，除去细胞表面吸附药物和纳米粒。收集细胞，加入2%的SDS溶液l(K)yL，震荡5min， 充分破坏细胞，加入0.5mL乙醇提取紫杉醇，10000巧m离屯、5min，取上清液，HPLC法测定，平 行操作3份，计算细胞摄取量。
[0052]从图4可见，各时间点测得MCF-7细胞和A549细胞对纳米粒的摄取量均高于溶液 组。A549细胞摄取紫杉醇-Soluplus自组装纳米粒在化至4h范围，随着时间的延长，摄取量 逐渐增大，但化下降，可能摄取的紫杉醇因细胞毒作用导致部分细胞调亡所致。MCF-7细胞 摄取紫杉醇-So 1 up 1US自组装纳米粒则在化至化范围，随时间的延长，摄取量逐渐增大。说 明Soluplus纳米粒自组装纳米促进了细胞对紫杉醇的摄取。
【主权项】
1. 一种紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统，其特征在于，所述的紫杉醇自组装聚合 物纳米粒给药系统主要包括紫杉醇和3〇11^)1118;基于所述的紫杉醇和3〇11^)1118，所述紫杉 醇的重量百分数为〇. 1 %~15%，所述SoIupIus的重量百分数为99.9%~85%。2. 如权利要求1所述的紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统，其特征在于，所述的紫杉 醇自组装聚合物纳米粒给药系统为液态分散制剂形式或为冻干制剂形式。3. -种液态分散制剂形式的紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统，其特征在于，由紫 杉醇、SoIupIus、水相组成；基于所述的紫杉醇和SoIuplus，所述紫杉醇的重量百分数为 0.1 %~15 %，所述Soluplus的重量百分数为99.9 %~85 %，所述水相的体积量为5~ 200mL/g So I up I u s;所述的水相由pH调节剂溶于水中配制而成，或者不含pH调节剂，直接为 水;所述的水为纯水、注射用水或灭菌注射用水;所述水相的pH值为3.0~9.0。4. 如权利要求3所述的液态分散制剂形式的紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统，其 特征在于，所述的pH调节剂为磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、氢氧化 钠、盐酸、柠檬酸、酒石酸中的至少一种。5. 如权利要求3所述的液态分散制剂形式的紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统的制 备方法，其特征在于，所述的制备方法为： 将紫杉醇和Soluplus溶于有机溶剂中，得到混合液，搅拌下，将所得混合液注入水相 中，之后除去有机溶剂，无菌过滤，即得液态分散制剂形式的紫杉醇自组装聚合物纳米粒给 药系统； 所述水相的体积用量以So Iup Ius的质量计为5~200mL/g，所述有机溶剂的体积用量以 紫杉醇的质量计为0.014~lmL/mg。6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为：乙醇、甲醇、丙酮、乙 酸乙酯、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、丁醇、戊醇中的一种或两种 以上任意比例的混合溶剂。7. -种冻干制剂形式的紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统，其特征在于，所述冻干 制剂形式的紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统由权利要求3所述液态分散制剂形式的紫 杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统加入冻干保护剂后冷冻干燥制得。8. 如权利要求7所述的冻干制剂形式的紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统，其特征 在于，所述冻干保护剂的质量用量以所述液态分散制剂形式的紫杉醇自组装聚合物纳米粒 给药系统的体积计为5~250mg/ml。9. 如权利要求7所述的冻干制剂形式的紫杉醇自组装聚合物纳米粒给药系统，其特征 在于，所述的冻干保护剂为葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、壳聚糖、海藻糖、甘露醇中的一种或两 种以上任意比例的混合物。
【文档编号】A61K47/34GK105878187SQ201610247223
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月19日
【发明人】熊素彬, 陈芳, 尹小东
【申请人】浙江工业大学