叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物及其合成方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种纳米聚合物自组装胶束材料及其应用，具体涉及一种叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物及其合成方法与应用，属于生物医用材料和纳米药物制剂领域。
【背景技术】
[0002]近年来，肿瘤的发生率和死亡率呈现明显上升趋势，已成为严重威胁人类健康的疾病，具有死亡率高、预后性差的特点。目前，化学疗法仍然是肿瘤治疗的主要方法之一，临床上常用的化疗药物以细胞毒性型药物为主，故药物在通过全身给药方式获得治疗效果的同时对人体正常的脏器也存在着较强的细胞毒性，继而引发严重的毒副作用。因此开发合适的制剂以提高难溶性化疗药物的溶解度，增加其靶向治疗以降低化学疗法带来的潜在危险是目前药物剂型开发和递送领域的研究热点。
[0003]聚合物胶束作为药物载体发展于20世纪90年代，是由两亲性的高分子聚合物在水中通过疏水基团的分子内和分子间作用力自发形成的一种具有典型核壳结构的自组装结构。该胶束系统由紧密的疏水内核和亲水性的外壳组成，难溶性药物可以通过疏水作用力包载于内核中。作为低毒、高稳定性的纳米载药系统，聚合物胶束系统可有效地改善难溶性药物的溶解性，延长药物在血液中的循环时间，改变药物的体内分布，提高药物生物利用度，并且具有一定的被动靶向性。这些优点可以有效降低化疗过程中的非特异性不良反应，提高治疗效能，尤为适用于肿瘤的治疗。然而，这些纳米给药系统不能有效地从网状内皮系统逃逸，且在体内很容易被单核巨噬细胞吞噬而清除。另一方面，这种依赖制剂纳米级粒径实现的被动靶向依然无法实现肿瘤部位充分摄取、易引发系统毒副反应甚至多药耐药从而降低疗效的现象。为了完成肿瘤纳米系统的靶向给药，利用体内的特异性分子识别机制，采用靶向纳米载体或在纳米载体表面偶联靶标分子已成为一种较为成熟的靶向策略。
[0004]硫酸软骨素是一种硫酸化的线性粘多聚糖，是由糖苷键链接葡糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖构成的二糖单元重复而成。硫酸软骨素广泛分布于动物组织中，主要存在于皮肤、血管、心脏瓣膜和肌腱部分，平均分子量约为2X104道尔顿。具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗凝血等多种生理活性。广泛应用于骨骼相关疾病、脑损伤复合等疾病的治疗。硫酸软骨素具有优良的水溶性，同时骨架中含有大量活泼的可修饰的游离基团，能够通过化学修饰赋予其新的性能。因此对以硫酸软骨素为亲水性基本骨架构架纳米给药系统的研究日益增多。此外，许多肿瘤细胞表面高表达CD44受体，除与透明质酸结合外，相关研究报道CD44也可特异性识别并结合硫酸软骨素。因此，期望以硫酸软骨素为骨架的纳米载体系统用以治疗过表达CD44受体的肿瘤细胞，达到提高药效、革E向治疗的目的。
[0005]脱氧胆酸(D0CA)是目前常用的疏水性改性修饰剂，其分子中既含有碳原子侧链末端的羧基及3、12位的羧基这类亲水基，也包含环戊烯菲这种疏水基。因此，期望通过化学手段将疏水性小分子D0CA引入硫酸软骨素骨架中从而构建两亲性聚合物并诱使其在水性介质中发生自组装聚合成为具有疏水内核的核壳结构胶束。
[0006]现有技术公开叶酸是一种小分子维生素，分子结构中含有喋呤环，需经内化才能被人体吸收。研究报道叶酸两种内化机制:一是低亲和力的跨膜蛋白，转运四氢叶酸、二氢叶酸进入细胞内；二是高亲和力的叶酸受体，可特异性高效吸收叶酸进入细胞内。叶酸受体是一种糖蛋白膜受体，高度表达于某些实体瘤细胞膜表面，而在正常组织低表达。叶酸受体可特异性识别并结合叶酸或叶酸偶联物，且具有高亲和性、选择性、饱和性和生物效应明显等优点。因此，将叶酸连接到聚合物胶束表面获得靶向癌细胞递送的特性，可以提高药物在病灶部位的浓度，提高疗效，降低毒副反应，达到靶向治疗的目的。
[0007]将硫酸软骨素、脱氧胆酸和叶酸相结合构建复合聚合物，并将其用于肿瘤的诊断和治疗具有很大的研究开发前景。但该设计尚未见相关报道。
【发明内容】
[0008]针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物及其合成方法。以硫酸软骨素作为水溶性骨架材料构建聚合物胶束，在硫酸软骨素分子上引入脱氧胆酸进行疏水改性，使其具备在水性溶液中自组装聚集的性能。通过聚合物表面叶酸的修饰，利用叶酸与叶酸受体、硫酸软骨素与CD44特异性结合，实现聚合物胶束对相关受体高表达的肿瘤组织的双靶向特性，实现纳米胶束的肿瘤细胞靶向药物递送。
[0009]本发明的另一个目的是提供该聚合物作为生物可降解性材料用于制备抗肿瘤药物肝靶向纳米制剂的应用。
[〇〇1〇]为实现上述目的，本发明采用下述技术方案:
[0011]—种叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物，是由硫酸软骨素接枝己二酸二酰肼后，与活化后的脱氧胆酸按质量比为1:〇.3-0.8反应，构建得到硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物，经叶酸修饰后制备而成的具有CD44和叶酸受体双靶向的聚合物胶束。
[0012]上述枝接己二酸二酰肼后的硫酸软骨素，其中己二酸二酰肼取代度范围为14-18%〇
[0013]上述硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物中，脱氧胆酸的取代度范围为4% -9%。
[0014]该叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物的合成方法，步骤为:
[0015]将硫酸软骨素、己二酸二酰肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺按质量比(0.3-0.4):(5-7):(1-1.2):(0.1-0.2)反应，制备得到硫酸软骨素-己二酸二酰肼；然后与活化后的脱氧胆酸按质量比1: (0.3-0.8)反应，制备得到硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物；向硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物中按质量比1: (〇.4-0.5)加入活化后的叶酸进行修饰，即得到叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物。
[0016]所述脱氧胆酸的活化方法为:将脱氧胆酸溶解于N，N_二甲基甲酰胺，向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温活化，调节PH7-9 ;脱氧胆酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为 1: (1.5-2.5): (1.5-2.5)。
[0017]所述叶酸的活化方法为:将叶酸溶解于二甲亚砜溶液，向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺，调节pH7-9,室温活化2-6小时；叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(1.5-2.5): (1.5-2.5)。
[0018]该叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物的合成方法，具体步骤如下:
[0019](1)硫酸软骨素-己二酸二酰肼的合成:将硫酸软骨素溶解于蒸馏水中，充分溶解后向其中依次加入己二酸二酰肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺，用氢氧化钠调节反应体系pH至6-7，室温搅拌反应20-30小时，得硫酸软骨素-己二酸二酰肼；
[0020](2)脱氧胆酸的活化:将脱氧胆酸溶解于N，N_ 二甲基甲酰胺，向其中依次加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺，室温活化30分钟，然后加入3-5滴有机碱调节pH7-9。
[0021](3)硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物的合成:将步骤⑴中所得的硫酸软骨素-己二酸二酰肼溶于蒸馏水中，搅拌使其充分溶胀、溶解，然后加入等倍体积N，N 二甲基甲酰胺稀释，备用；将活化的脱氧胆酸溶液在强烈搅拌下滴入上述硫酸软骨素-己二酸二酰肼溶液中，室温搅拌反应40-50小时，得到反应物溶液，反应溶液经纯化、冷冻干燥即得硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物。
[0022](4)叶酸的活化:将叶酸溶解于二甲亚砜溶液，向其中依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺，加适量三乙胺调节pH7-9，室温活化2-6小时，使叶酸充分溶解。
[0023](5)叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物的合成:将步骤(3)中所得的硫酸软骨素-脱氧胆酸溶于蒸馏水中，搅拌使其充分溶胀、溶解，然后加入二倍体积二甲亚砜稀释，备用；将活化的叶酸溶液在强烈搅拌下滴入上述硫酸软骨素-脱氧胆酸溶液中，室温搅拌反应40-50小时，得到反应物溶液，反应溶液经纯化、冷冻干燥即得叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物。
[0024]步骤⑴中，所述硫酸软骨素、蒸馏水、己二酸二酰肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(0.3-0.4): 100:(5-7):(1-1.2):(0.1-0.2)。硫酸软骨素的分子量为10kD。硫酸软骨素-己二酸二酰肼的己二酸二酰肼取代度为14-18% (优选为16% )。
[0025]本发明将硫酸软骨素接枝己二酸二酰肼之后，引入末端氨基，该氨基与脱氧胆酸的羧基发生酰胺反应，由此构建硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物，这种合成方法可以提高反应活性，获得较为理想的脱氧胆酸取代度。
[0026]步骤(2)中，脱氧胆酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、有机碱的摩尔比为1:(1.5-2.5):(1.5-2.5):(1.5-2.5)，优选为1 '2:2:2 ；N, N二甲