一种靶向于肿瘤微环境的电荷翻转型药物载体、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种具有电荷翻转型特性的聚合物混合胶束，其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤微环境是指由肿瘤细胞、基质细胞和细胞外基质等共同构成的局部稳态环 境，为肿瘤的生长、侵袭、转移提供了重要的物质基础，肿瘤微环境有低氧、低抑值和高压 等特点。近年来，针对肿瘤微环境的W上特点，设计祀向于肿瘤微环境的给药系统成为中外 学者们的研究热点。
[0003] 细胞穿膜肤（cell-penetratingpeptides,CPPs)，是一类由不多于30个氨基酸 残基组成的小分子多肤，具有很强的跨膜转运能力，根据氨基酸组成的不同，可分为阳离子 CPPs和两亲性CPPs。由于细胞穿膜肤具有很强的跨膜转运能力，且无刺激性。尽管CPPs 能够有效介导外源性生物大分子的入胞作用，但由于缺乏特异性限制了CPPs的体内应用。 基于阳离子CPPs的电荷特性，近年来基于CPPs设计的电荷翻转型材料已经成为新的研究 热点。
[0004] 基于CPPs设计的电荷翻转型材料主要由3部分组成：（1)CPP;似保护基团； (iii)中和CPPs正电荷的材料。其中CPPs部分一般选择阳离子寡聚精氨酸，保护基团为与 寡聚精氨酸含有等量电荷数的阴离子多肤，一般选择寡聚谷氨酸，将CPPs与可中和其正电 荷的材料相连接，可W中和其正电性，因此，可W使CPPs的膜穿透能力在其到达祀部位前 得W暂时屏蔽。
[0005] 近年来，基于CPPs设计出的电荷翻转型载体材料有很多文献报道，有研究学者设 计出基于组氨酸-谷氨酸（肥）重复序列，即在抑7. 4时，载体所携带的负电荷能够抑制 CPPs的活性，而抑< 7. 0时，组氨酸的存在能够干扰谷氨酸与CPPs的吸附作用，从而使 CPPs恢复穿膜特性。运种基于CPPs正电荷性质设计的电荷翻转型载体，为用于祀向具有类 似微环境的肿瘤组织的给药系统的开发提供了全新的思路和途径。
[0006] 本发明的聚合物与多肤偶联混合胶束，是利用醋键将胆固醇修饰聚氧乙締山梨醇 油酸醋分别与组氨酸-谷氨酸多肤和精氨酸-甘氨酸多肤相偶联，修饰抑敏感的在肿瘤酸 性条件下可实现电荷逆转的多肤后，使得该载体表现出易于与肿瘤细胞亲和的祀向性。本 发明是一种载疏水性药物的聚合物胶束药物递释系统，对肿瘤祀向治疗具有重要意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的之一在于提供一种祀向于肿瘤微环境的电荷翻转型药物载体。本发 明使用安全性更高的聚氧乙締山梨醇油酸醋材料作为主体，同时W生物相容性高的胆固醇 作为配体对其进行修饰。形成为聚氧乙締山梨醇油酸醋分子为亲水端，W胆固醇为疏水端 的两亲性载体（CPS0)。再W抑敏感的组氨酸-谷氨酸多肤（肥)m和细胞穿膜肤精氨酸-甘 氨酸多肤（RG)n对胆固醇修饰聚氧乙締山梨醇油酸醋载体进行修饰，使用透析法将修饰后 的两亲性聚合物制备成胶束。
[0008] 本发明的目的之二在于提供一种祀向于肿瘤微环境的电荷翻转型药物载体的制 备方法。
[0009] 本发明的目的之Ξ在于提供一种祀向于肿瘤微环境的电荷翻转型药物载体在制 备抗肿瘤药物中的用途。
[0010] 本发明提供如下技术方案：
[0011] (1)W聚氧乙締山梨醇油酸醋和胆固醇甲酯氯为原料，采用酷化反应合成胆固醇 修饰的聚氧乙締山梨醇油酸醋（CPS0)。 阳〇1引 似使用探头超声-透析法将她)m和做)η修饰的胆固醇修饰聚氧乙締山梨醇 油酸醋制备为混合胶束。
[0013] 本发明采用酷化反应合成胆固醇修饰的聚氧乙締山梨醇油酸醋，聚氧乙締山梨醇 油酸醋和胆固醇甲酯氯的摩尔比例范围为1.1 : 1-1.4 : 1，优选1.25-1 ;采用的溶剂可W 是二氯甲烧、四氨巧喃，优选二氯甲烧；采用的催化剂为4-二甲氨基化晚；反应溫度范围为 室溫-40°C;反应时间为18-48小时，优选24小时。反应结束后，使用旋转蒸发法除去有机 溶剂，加入5-40ml蒸馈水水化，优选15ml，5000-10000巧m下离屯、5-20min，优选8000;rpm， lOmin。后冷冻干燥保存。
[0014] 本发明采用醋化反应将多肤的簇基与胆固醇修饰聚氧乙締山梨醇油酸醋载体中 的径基相偶联。采用固相合成法，W精氨酸-甘氨酸多肤（RG)n和组氨酸-谷氨酸多肤（肥） m为原料，使用化f保护基保护（RG)η侧链胺基，Boc保护基保护末端胺基，使用Fmoc保护 基保护她)m末端胺基。她)m和做)η与胆固醇修饰聚氧乙締山梨醇油酸醋的摩尔比例 范围为0.9 : 1-1.3 : 1，优选1 : 1;合成反应时使用水、Ν，Ν-二甲基甲酯胺、二甲基亚讽 或上述几种溶剂的混合溶剂，优选水和Ν，Ν-二甲基甲酯胺50 : 50混合溶剂，冰水浴下揽 拌20-60分钟，优选30分钟，加入1. 3至2当量的1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺 盐酸盐，优选1. 5当量；0. 5至1当量的4-二甲氨基化晚，优选0. 8当量；反应溫度范围为 室溫-40°C;反应时间为18-48小时，优选24小时。合成反应纯化，既可W采用透析袋透析 纯化，也可W采用离屯、浓缩管纯化，优选离屯、浓缩管，W节约时间，便于冷冻干燥。
[0015] 本发明采用切割试剂脱化f和Fmoc保护基，配制赃晚：二氯甲烧体积比在1 : 9 至3 : 7的切割试剂，优选2 : 8,用切割试剂溶解（肥)m偶联的胆固醇修饰聚氧乙締山梨醇 油酸醋冻干粉，冰浴下揽拌20至40分钟，优选30分钟，旋转蒸发出去二氯甲烧，透析袋透 析纯化或离屯、浓缩管纯化，优选离屯、浓缩管，纯化后冷冻干燥。配制Ξ氣乙酸：1,2-乙二 硫醇：苯甲硫酸：水：对甲苯酪体积比例65 : 10 : 5 : 10 : 10至93 : 2 : 1 : 2 : 2 范围内的切割试剂，优选82. 5 : 5 : 2.5 : 5 : 5,用切割试剂溶解（RG)n偶联的胆固醇 修饰聚氧乙締山梨醇油酸醋冻干粉。冰水浴下揽拌2至4小时，优选3小时，冰乙酸沉淀， 5000-10000巧m下离屯、5-20分钟，优选8000巧m，10分钟，透析袋透析纯化或离屯、浓缩管纯 化，优选离屯、浓缩管，纯化后冷冻干燥。
[0016] 本发明采用探头超声-透析法制备载药胶束，溶剂为水，超声时间为40-70 分钟，优选59分钟；超声功率为10% -30%，优选20 % ;药物和聚合物的质量比范围 为1 : 3-1 : 6,优选1 : 4;透析时间范围为8-24小时，优选12小时，透析产物在 2000-5000巧m下离屯、10-20分钟，优选3000巧m，15分钟。
[0017]本发明W多种疏水性小分子抗癌药物（如紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素等）其中一 种为模型，按照上述方法制备载药胶束，载药量为15 %至20 %，24小时至120小时可完全释 放。
【附图说明】
[001引图1为本发明中载紫杉醇的胆固醇修饰的聚氧乙締山梨醇油酸醋胶束，和载紫杉 醇的精氨酸-甘氨酸多肤（RG) 5和组氨酸-谷氨酸多肤（肥)5分别与胆固醇修饰的聚氧乙 締山梨醇油酸醋相偶联形成的混合胶束的粒径分布图。
[0019] 图2为本发明中含有不同比例的混合胶束在不同抑的PBS缓冲液里的Zeta电荷
[0020] 图3为本发明中的混合胶束在不同抑的PBS缓冲液里及市售Taxol?在抑7. 4中 的体外释放曲线。 阳02U 图4为不同浓度的Taxol?、载紫杉醇的CPS0胶束和载紫杉醇的MCPS0胶束在U87 细胞中的抑制率
[0022] 图5为不同浓度的空白载体化emo地orEL:乙醇=1 :l(v/v)溶媒、空白Tween 80、空白CPS0胶束和空白MCPS0胶束在U87细胞中的抑制率。
[0023] 图6为载香豆素的Tween80、CPS0、MCPS0在抑6. 0和抑7. 4时30分钟，120分 钟和240分钟的平均巧光强度。
【具体实施方式】
[0024] 下面为本专利的实施例，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。 阳02引 实施例1 :
[0026] 合成条件
[0027] (1)胆固醇修饰的聚氧乙締山梨醇油酸醋（CPS0)的合成
[0028] W聚氧乙締山梨醇油酸醋（PS0)和胆固醇甲酯氯为原料，合成胆固醇修饰的聚 氧乙締山梨醇油酸醋（CPS0)。聚氧乙締山梨醇油酸醋（PS0)和胆固醇甲酯氯摩尔例为 1.25 : 1。取PSOlg和胆固醇甲酯氯0. 125g，及催化剂4-二甲氨基化晚（DMAP)0.016g，置 于25ml圆底烧瓶中，加入溶剂10ml二氯甲烧后，室溫下磁力揽拌2地。反应结束后，在50°C 下真空旋转蒸发除去二氯甲烧，再加入10ml蒸馈水水进行水化，待圆底烧瓶壁上固体溶解 后，常溫下，10000转离屯、lOmin，取上清液冻干，待用。
[0029] (2)(肥）5-Fmoc及（RG) 5-Pbf的合成
[0030] 采用固相合成法，W精氨酸-甘氨酸多肤做)5和组氨酸-谷氨酸多肤她)5为 原料，使用Pbf保护基保护（RG) 5侧链胺基，Boc保护基保护末端胺基，使用Fmoc保护基保 护（肥)5末端胺基。 阳0別]做她)5-Fmoc及做)5-Pbf簇基的活化，并与载体CPS0相偶联
[0032]CPS0-(肥)5-Fmoc:称取（肥)5-FmoclOOmg，用2血蒸馈水溶解，揽拌10-20分 钟后，将装有此溶液的圆底烧瓶浸溃于冰水浴中5-10分钟，在冰水浴条件下分别加入 邸C21.4mg(1.5eq)及DMAP7. 2mg0. 8eq)，将CPS0 179mg(leq)用蒸馈水（2ml)溶解待 肥