一种新型糖纳米胶束及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新型糖纳米胶束及其制备方法和应用，尤其是一种具有肿瘤组织 靶向性的糖纳米胶束，属于药物和药剂学领域。
【背景技术】
[0002] 癌症（恶性肿瘤）是当今严重威胁人类健康的主要疾病之一。但是由于目前临床 用于肿瘤治疗的大多数药物显示出低的溶解性、有限的稳定性、快速的血液清除和缺乏对 肿瘤部位的靶向性，进入体内后会产生非特异性分布，即在肿瘤组织与正常组织都有分布， 因此在杀伤肿瘤细胞的同时也损伤了人体正常组织细胞，从而导致疗效低、毒副作用强等 缺点，且长期使用容易产生耐药性。
[0003] 为了提高化疗效率，巨大的研究工作一直致力于开发具有肿瘤靶向性的纳米药物 载体用于可控的抗癌药物输送。目前，许多纳米药物载体包括脂质体、聚合物纳米粒子、纳 米胶束、树枝状大分子等已经被开发利用增强的渗透和保留（EPR)效应用于抗癌药物输 送。EPR效应往往不能够有效消除细胞毒性药物的毒副作用以及在癌细胞里选择性的发挥 抗癌作用。因此，增强化疗药物的抗肿瘤效果并减少其毒副作用成为目前临床亟待解决的 问题，开发更好的靶向药物传输系统对于肿瘤的治疗已迫在眉睫。
[0004] 目前应用广泛的靶向试剂主要包括抗体（单克隆抗体）以及多肽类（精氨酸-甘 氨酸-天冬氨酸（RGD))。然而这些靶向试剂本身稳定性差，直接包覆或者修饰在纳米材料 表面输送到体内容易被降解而无法发挥其靶向作用。近年来，糖化学的迅速发展使得糖类 成为新型靶向试剂引入到纳米材料表面行使靶向功能，其良好的稳定性、水溶性以及生物 相容性是其他靶向试剂无法比拟的。糖类是自然界最丰富的生物分子，也是生物体中一系 列生命过程的基本元素。除了可以组成生命体的结构并为之提供能量，糖类还可以通过其 与蛋白质、核酸、脂质和其他分子之间的相互作用来广泛介导生命体系中的识别过程，例如 细胞通讯和迀移、肿瘤的产生和发展、免疫应答、受精、细胞凋亡和感染等。但是，单一的糖 基与蛋白亲和力非常弱，受体蛋白对其的选择性也很低，远远达不到生理条件下识别作用 对结合强度和特异性的要求。因此，多价糖基与蛋白受体的协同作用的效果远远高于单个 糖基作用效果的加和，产生"多价效应"。糖类物质已经被广泛用于修饰磁性纳米材料、金纳 米材料、量子点、聚合物等用于细菌检测、病原体检测以及生物医学成像等。然而，利用糖类 物质的多价效应用于自组装胶束的靶向药物输送治疗癌症仍是一种挑战。
【发明内容】
[0005] 本发明提出了通过自组装技术构建具有靶向功能的糖纳米药物载体的新方法，利 用来源丰富的环糊精作为自组装的构建单元，通过在环糊精分子初级羟基面中引入靶向分 子（如甘露糖、半乳糖等），可实现组装体针对特定癌细胞或组织的靶向性，由于初级羟基 面的七个羟基全部被靶向分子取代，靶向分子与环糊精分子的比例为7:1，因此为多价修 饰；通过在环糊精分子次级羟基面中引入不同链段长度的脂肪链，可得到粒径大小可控的 一系列糖纳米药物载体。
[0006] 本发明首先提供了一种两亲性环糊精分子，是在环糊精分子的初级羟基面中引入 单糖或寡糖类分子，在环糊精分子的次级羟基面中引入疏水脂肪链。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述两亲性环糊精分子的结构如式1所示：
[0008]
[0009]式 I 中，
[0010] A为具有靶向功能的单糖或寡糖类分子，可以识别癌症细胞表面过度表达的受 体；
[0011] B为如下连接键中的一种：酯键（一C00 -）、酰胺键（一C0NR -）、二硫键（一S- S-）、醚键（一0-）、碳氮键（一C一N(R)-）、1，4_ 三氮唑环,N-、 ( N'~N )*
[0012] 式I中包含脂肪链的结构，n表示脂肪链的碳链长度，n为1，2或4。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述单糖或寡糖类分子为甘露糖、半乳糖、乳糖、唾 液酸及甘露聚糖等。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述单糖或寡糖类分子为甘露糖或半乳糖。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述疏水脂肪链为直链脂肪链。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述脂肪链为乙酸酐、丙酸酐或戊酸酐。
[0017] 本发明还提供了一种制备所述两亲性环糊精分子的方法，首先将环糊精6号位全 部羟基碘代、叠氮化，再与端基位用炔丙基修饰的单糖进行click环加成反应得到含有亲 水端的环糊精，然后，将环糊精次级羟基面与酸酐进行酯化反应从而得到两亲性环糊精分 子。
[0018] 本发明还提供了应用上述的两亲性环糊精分子制备糖纳米胶束的方法，包括如下 步骤：
[0019]1)所述的两亲性环糊精分子用DMS0溶解，搅拌5小时；
[0020] 2)在双蒸水中透析48小时，每隔6小时换水一次，制得胶束溶液；
[0021] 3)将胶束溶液经冷冻干燥机冻干，制得胶束。
[0022] 所形成的纳米胶束的平均粒径为20_200nm。
[0023] 本发明还提供了应用上述的两亲性环糊精分子制备载药糖纳米胶束的方法，包括 如下步骤：
[0024] 1)将两亲性环糊精分子和药物分别用DMS0溶解，将两种溶液混合搅拌5小时；
[0025] 2)混合溶液在双蒸水中透析48小时，每隔6小时换水一次，制得载药胶束溶液；
[0026] 3)将聚合物胶束溶液经过0. 45 y m的微膜过滤除去未负载的药物，经冷冻干燥机 冻干，制得负载药物的胶束。
[0027] 在本发明的一种实施方式中，所述抗癌药物为阿霉素。
[0028] 本发明的另一个方面涉及所述的两亲性环糊精分子作为药物载体的用途。具体 地，所述药物为抗癌药物、抗肿瘤药物，具体地，所述抗癌药物为阿霉素。
[0029] 两亲性环糊精次级羟基面的脂肪链是为了提供疏水部分，与疏水性的抗癌药物， 例如阿霉素，相互所用将其包裹在其输水内核。通过选择不同链段长度的脂肪链提供疏水 部分，从而可以调节形成纳米胶束的大小，达到控制载药量和包封率的效果。两亲性环糊精 初级羟基面的单糖或寡糖分子，具有好的生物相容性，并且这类分子具有很好的靶向性，能 够携带抗癌药物阿霉素穿过细胞膜，甚至是核膜进入细胞核，可作为各类药物的输送载体。
[0030] 本发明合成的两亲性环糊精胶束具有较低的细胞毒性，在实验的条件下， C 3- 0 -CD-Manj_$束达到800 yg/mL的浓度时和人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞以及人肾脏 上皮细胞ffiK 293细胞共同孵育48小时，细胞存活率均高于91 %。通过荧光共聚焦显微镜 测试证明了表面键连甘露糖分子的载药胶束可以被细胞膜表面有过度表达的甘露糖受体 的MDA-MB-231细胞内吞，而只有少量的载药胶束可以被细胞膜表面有低表达的甘露糖受 体的HEK293细胞内吞，说明载药胶束对特定癌细胞或组织具有靶向性。
【附图说明】
[0031] 图1 :C3-0 -CD-Man7胶束的粒径分布图。
[0032] 图2 :C5_ 0-⑶-Man7胶束的粒径分布图。
[0033] 图3:人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞与HEK 293细胞在不同浓度 D0X-C3-e -⑶-Man7载药胶束存在条件下培养48小时后的相对存活率。
[0034] 图4:(A)MDA-MB-231和（B)HKE 293细胞的流式结果，（a)空白参照，（b)在含有 甘露糖竞争条件下载药胶束被细胞内吞的实验结果，c)无甘露糖竞争条件下的载药胶束被 细胞内吞的实验结果。
[0035] 图5 :MDA-MB_231细胞摄取载药纳米胶束的相对荧光强度。
【具体实施方式】
[0036] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规产品。
[0037] 下面的实施例中所用缩写为：DMF，N，N'-二甲基甲酰胺；⑶，环糊精； 0 _⑶-1，六号位全碘代的环糊精；0 _⑶_N3，六号位全叠氮化的环糊精；C3_ 0 -⑶_N3, 2, 3 号位全丙酰化，6号位全叠氮化的环糊精；C2-0-CD_N3, 2, 3号位全乙酰化，6号位全叠氮 化的环糊精；C5-P -⑶-N3,2, 3号位全戊酰化，6号位全叠氮化的环糊精；DMAP，4-二甲氨 基吡啶；C2_ -⑶-Man7，一端乙酰基修饰，另一端甘露糖修饰的环糊精；C3_ -⑶-Man7， 一端丙酰基修饰，另一端甘露糖修饰的环糊精；C5-0 -⑶-Man7，一端戊酰基修饰，另一端 甘露糖修饰的环糊精；C3-0 -CD-Gal7，一端丙酰基修饰，另一端半乳糖修饰的环糊精； C3-0 -⑶-Lac7, 一端丙酰基修饰，另一端乳糖修饰的环糊精；C3-0 -⑶_SA7, 一端丙酰基修 饰，另一端唾液酸修饰的环糊精；C3- 0 -CD-Mannan7，一端丙酰基修饰，另一端甘露聚糖修饰 的环糊精；D0X-C3- 0 -CD-Man7，载有阿霉素药物的C3- 0 -CD-Man7胶束；C 3- 0 -CD-Gal7，载 有阿霉素药物的C3-0 -⑶-Gal7胶束；DMSO,二甲亚砜；DAPI，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚； DMEM，高糖培养基；MTT，3-4, 5-二甲基噻唑-2-2, 5-二苯基四氮唑溴盐，噻唑蓝，一种染料。 MDA-MB-231细胞，人乳腺癌细胞，细胞表面过度表达甘露糖受体；HEK293,人肾脏上皮细 胞，细胞表面甘露糖受体及去唾液酸蛋白受体呈低表达状态；HepG2