一种多功能纳米药物载体及其形成的载药胶束及载药胶束制备方法与流程

本发明属于生物医药和纳米医学技术领域，具体涉及一种长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体及其形成的载药胶束及载药胶束制备方法。

背景技术：

纳米药物载体在输送药物过程中面临诸多的障碍，靶向肿瘤的药物输送是一个体内五步串联的过程：1）在血液循环系统中保留较长时间（血液屏障），以实现2）肿瘤组织中的高效富集（EPR效应），3）在肿瘤组织渗透到各个部分以到达所有肿瘤细胞，4）能够快速进入肿瘤细胞，并5）在胞内将药物快速释放。然而，对于多功能的纳米药物载体，每一新的功能势必增加了体系的复杂性并带来新的问题，并且不同特定功能之间往往会产生一定的矛盾。例如，一些药物载体表面修饰亲水性较好的聚合物以避免网状内皮系统的快速清除，获得较好的长循环性能并提高肿瘤部位的富集量。但是，研究表明，这些载体不易被肿瘤细胞内吞，降低肿瘤治疗效果。与此同时，一些具有良好应用前景的靶向药物载体具有良好的肿瘤细胞内吞能力，然而长循环及肿瘤部位的高效富集难以实现，此外，对于一些表面修饰了靶向基团如c(RGDfK)的纳米粒子，c(RGDfK)直接暴露在纳米粒子表面，易与血液中的调理素相互作用，使得纳米粒子在调理素作用下，促使其被网状内皮系统快速清除，并可能会引起免疫反应，大大降低了抗肿瘤疗效。

目前解决长循环和细胞内吞的研究主要集中表面聚乙二醇（PEG）可脱离的纳米载体。这种纳米药物载体在血液循环过程中，在PEG的屏蔽作用下，载体材料可以在一定程度上避免体内网状内皮系统的快速清除，提高了血液循环时间。同时，在EPR效应发挥作用后，载体材料进入肿瘤组织，在肿瘤组织微环境如弱酸性、过度表达的酶类等响应性刺激下，PEG响应性脱除，从而发生电荷转变或暴露出的靶向于肿瘤细胞的靶向基团，提高细胞内吞能力。尽管如此，目前大部分的PEG脱壳研究仍然处于细胞水平，体内的验证还没有实现。同时，脱壳过程及脱壳机理较为复杂，适用范围较窄。因此，为解决长循环和细胞内吞的矛盾，需要发展新型具有协同作用的纳米药物载体系统，提高抗肿瘤治疗效果。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种多功能纳米药物载体，该药物载体保留了表面PEG修饰及表面结构所带来的长循环性能，同时可有效提高肿瘤细胞摄取能力，有效提高抗肿瘤治疗效果。

本发明的另一目的在于提供所述多功能纳米药物载体的制备方法。

本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：

一种多功能纳米药物载体，由粒径为30~200 nm且均匀分布的复合胶束组成；

所述复合胶束由双亲性嵌段共聚物A和双亲性嵌段共聚物B通过在水溶液中自组装形成，

所述双亲性嵌段共聚物A为聚乙二醇-b-聚环己内酯，即PEG-b-PCL1，其亲水端为聚乙二醇PEG、疏水端为聚环己内酯PCL1；

所述双亲性嵌段共聚物B为聚环己内酯-b-聚β氨酯-c(RGDfK)，即PCL2-b-PAE-c(RGDfK)，其中c(RGDfK)为短链环肽，所述短链环肽的氨基酸序列为cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Lys)，其亲水端为PAE-c(RGDfK)、疏水端为聚环己内酯PCL2；

所述PCL1、PCL2的分子量为2~10kDa，且其差值<5kDa；

所述复合胶束在pH 为7.4水溶液中为核-壳结构，其中核为疏水端PCL，壳层为PEG和PAE-c(RGDfK)的复合壳层。

优选地，所述复合胶束的粒径约为100nm。

一种载药胶束，所述载药胶束中由药物成分和载体构成，所述载体为所述多功能纳米药物载体。

优选地，所述药物成分与载体的质量比为1:1。

优选地，所述多功能纳米药物载体中，双亲性嵌段共聚物A与双亲性嵌段共聚物B的质量为1:1。

优选地，所述多功能纳米药物载体的分子量为12~14kDa。

优选地，所述药物成分为阿霉素。

所述载药胶束的制备方法，包括如下步骤：

S1.制备双亲性嵌段共聚物A PEG-b-PCL1；

S2.制备双亲性嵌段共聚物B PCL2-b-PAE-c(RGDfK)；

S3.将双亲性嵌段共聚物A与双亲性嵌段共聚物B分别溶解于溶剂中，制成溶液C、溶液D；将药物成分制成溶液E；

S4.将溶液C、溶液D与溶液E混合，形成混合溶液；控制混合溶液pH为4以下，除去溶液中的溶剂，再调节混合溶液pH为7.4，并进行透析，截留需要的分子量，得到所述载药胶束。

优选地，S3.中，所述溶剂为氯仿。

优选地，S4.中除去溶液中的溶剂的方法为在常温下挥发和/或室温下真空去除。

与现有技术相比，本发明具有以下有益技术效果：

本发明制备的纳米药物载体，表面结构可通过改变不同嵌段共聚物比例灵活调控；靶向基团针对肿瘤细胞具有特异性靶向作用；载药系统具有响应性释放能力，在酸性条件下释放相对较快，而在正常组织环境中释放较慢；载药体系生物相容性较好，并具有生物可降解性；制备工艺简单、易于操作。因此尤其构成的载药胶束保留了表面PEG修饰及表面结构所带来的长循环性能，同时可有效提高肿瘤细胞摄取能力，有效提高抗肿瘤治疗效果。

附图说明

图1为本发明所述双亲性嵌段共聚物A、双亲性嵌段共聚物B的合成路线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和对比例对本发明做进一步的详细说明，但本发明并不限于下述实施例。

实施例中，所用的原料均为市售商品。实施例中，所述的百分含量为重量百分含量。

实施例1

一种载药胶束，由药物成分阿霉素，及多功能纳米药物载体构成。

所述多功能纳米药物载体，由粒径为100 nm且均匀分布的复合胶束组成；

所述复合胶束由双亲性嵌段共聚物A和双亲性嵌段共聚物B通过在水溶液中自组装形成，

所述双亲性嵌段共聚物A为聚乙二醇-b-聚环己内酯，即PEG-b-PCL1，其亲水端为聚乙二醇PEG、疏水端为聚环己内酯PCL1；

所述双亲性嵌段共聚物B为聚环己内酯-b-聚β氨酯-c(RGDfK)，即PCL2-b-PAE-c(RGDfK)，其中c(RGDfK)为短链环肽，所述短链环肽的氨基酸序列为cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Lys)，其亲水端为PAE-c(RGDfK)、疏水端为聚环己内酯PCL2；所述复合胶束在pH 为7.4水溶液中为核-壳结构，其中核为疏水端PCL，壳层为PEG和PAE-c(RGDfK)的复合壳层。

上述载药胶束通过如下方法制成：

1）聚乙二醇-b-聚环己内酯（PEG_2k-b-PCL1）的合成

以端羟基聚乙二醇（CH₃O-PEG₄₅-OH）为引发剂，以辛酸亚锡[Sn(Oct)₂]为催化剂，以ε-己内酯（ε-CL）为单体，开环聚合制备，具体方法是：将干燥处理过的端羟基聚乙二醇2.0 g和减蒸处理过的ε-CL 5.0 g溶于重蒸过的20 mL无水甲苯中，加入50 μL Sn(Oct)₂，依次进行液氮冷冻、抽真空、通氮气、解冻，重复三次，110℃油浴中反应12 h，反应后旋蒸除去甲苯，加入20 mL二氯甲烷溶解粘稠物后，在200 mL冰乙醚中沉淀，抽滤洗涤后，将固体产物置于真空烘箱中干燥，即可得到白色固体聚乙二醇-b-聚环己内酯（PEG2k-b-PCL）；

2）聚环己内酯-b-聚β氨酯-c(RGDfK)[ PCL-b-PAE-c(RGDfK)]的合成

利用开环聚合和迈克尔加成反应通过连续反应制备，具体方法是：将叔丁氧羰基氨基乙醇（BOC-NH-C₂H₄OH）0.1 g和减蒸过的ε-己内酯（ε-CL）3.5 g置于茄型瓶中，加入10 m重蒸过的甲苯溶解，加入50 μL辛酸亚锡[Sn(Oct)₂]，依次进行液氮冷冻、抽真空、通氮气、解冻，重复三次，然后在110℃油浴中反应12 h，反应后旋蒸除去甲苯，加入5 mL二氯甲烷溶解粘稠物后，在50mL冰乙醚中沉淀，抽滤洗涤后，将固体产物置于真空烘箱中干燥，得到PCL的均聚物PCL-OH；

将上述2.5 g PCL-OH、0.25 g三乙胺（TEA）和5 mL重蒸后的二氯甲烷混合均匀得到混合液a，将圆底烧瓶置于冰水浴中，然后将0.18 g丙烯酰氯溶解于0.18 g重蒸后的二氯甲烷中，混合均匀得到混合液b，加入到恒压滴液漏中，将混合液b在氩气氛围下逐滴缓慢滴入到圆底烧瓶混合液a中，混合液a与混合液b的质量比7:10，滴加完毕后封闭反应体系，缓慢升至室温，在氩气氛围下反应12 h后，萃取反应液，用饱和碳酸钠溶液、0.1 mol/L的盐酸溶液和纯水分别洗涤至少三次，取有机相，用无水硫酸镁干燥8~10 h，抽滤，旋蒸浓缩后在冰乙醚中沉淀，静置8-10 h后抽滤，用无水乙醚洗涤后，将固体置于真空烘箱中干燥，即可制得端基碳碳双键功能化的PCL-A；

将上述PCL-A 0.5 g、 己烷-1,6-二醇-二丙烯酸酯（HDD）0.68 g和4,4′-三亚甲基-二哌啶（TDP）0.69 g混合后，加入10 mL氯仿溶解，55℃油浴中反应，72 h后，在反应液中加入0.305 g N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺（NAS），继续反应12 h，封端并终止反应，即可得到黄色固体PCL-b-PAE-NAS；

将80 mg上述PCL-b-PAE-NAS和16 mg短链环肽[c(RGDfK)]混合后，加入5 mL体积比为3:2的DMF和氯仿的混合溶剂，然后加入200 μL三乙胺（TEA），30℃下搅拌反应8~10h，反应液旋蒸除去氯仿，在超纯水中透析，透析袋截留分子量为12-14k Da，每天换水四次，透析三天后，冷冻干燥，即可制得聚环己内酯-b-聚β氨酯-c(RGDfK)[ PCL-b-PAE-c(RGDfK)]；

3）室温下分别将步骤1）和2）中所得到的两种嵌段共聚物PCL-b-PAE-c(RGDfK)和PEG-b-PCL分别溶解在有机溶剂氯仿中，得到两种聚合物溶液，这两种溶液的浓度均为2 mg/mL；另外将阿霉素盐酸盐加入到氯仿中，再加入三乙胺中和阿霉素盐酸盐中的盐酸，制得浓度为2 mg/mL的阿霉素溶液；

4）将步骤3）中制备得到的两种聚合物溶液和阿霉素溶液按照体积比为1：1：1均匀混合，得到混合溶液；

5）将上述混合溶液在超声搅拌下逐滴加入到pH 为4.0、浓度为10-4 mol/L的盐酸中，滴加完全后，在35℃下剧烈搅拌挥发至有机溶剂基本挥发完全，然后在室温下旋蒸至完全除去未挥发干净的有机溶剂，加入浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.4，在超纯水中透析，所用透析袋截留分子量为12~14 kDa，透析两天后，经超滤离心浓缩，即可制得所述载药胶束（RMSM-DOX）。

实验分析：

1）RMSM-DOX的体外阿霉素释放

分别取1 mL载药胶束RMSM-DOX溶液于透析袋（透析袋截留分子量：12~14 kDa）中，置于3 mL的缓冲溶液中，在三种不同pH（pH 7.4，6.5和5.0）37 ℃电磁搅拌下，每隔一段时间取出1 mL缓冲溶液用荧光分光光度计测定其波长在592 nm处的荧光强度，并加入1 mL新的缓冲溶液，保证透析袋外溶液体积不变，利用阿霉素在水中的标准曲线来计算阿霉素的累积释放量。

2）多功能抗肿瘤纳米载药胶束的细胞毒性实验

采用MTT法，以HepG2细胞为研究对象评价载药胶束的细胞毒性。将HepG2细胞以每孔4000个分别接种到96孔板中。加入500 μL RPMI1640的细胞培养液，在5% CO₂，在37 °C下分别孵育24 h。之后每孔加入不同浓度（0.001, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 5, 10和50 μg/mL）的自由阿霉素药物组（free DOX）和载药胶束组（RMSM-DOX）。分别在两个pH（7.4和6.5）下继续培养2 h，之后弃去培养液，加入500 μL新鲜的培养基，继续培养24 h，之后每孔加入25 μL 5 mg/mL的MTT溶液，4 h后弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO，室温孵育15~20 min，振荡培养板，用酶联检测仪在570 mm波长检测光吸收值，计算细胞相对增殖百分率，并根据结果估测半抑制率IC₅₀。

3）多功能抗肿瘤纳米载药胶束的细胞摄取实验

将HepG2细胞以每孔10⁵个接种到96孔板中，每孔均加入500 μL RPMI-1640培养基，培养24 h后，弃去原培养基并加入500 μL新鲜培养基，其中分别含10 μg/mL阿霉素的自由阿霉素药物组（free DOX）和载药胶束组（RMSM-DOX）。分别在两个pH（7.4和6.5）下继续培养2 h，之后弃去培养液，并用500 μL PBS缓冲溶液洗涤三次。在倒置荧光显微镜（DMI6000B, Leica, Wetzlar, Germany）下观察不同胶束的细胞摄取情况。研究结果显示，自由阿霉素药物组在pH 7.4和6.5下，细胞中阿霉素的荧光强度均较弱且变化不大。载药胶束组在pH 7.4时，阿霉素荧光强度较弱，而在pH 6.5时荧光强度大大增加，并高于自由阿霉素药物组。

4）多功能抗肿瘤纳米载药胶束的抗肿瘤药效研究

将HepG2细胞以4×10⁵的量移植到BALB/c裸鼠的腹部。培养4-5周，当荷瘤小鼠的肿瘤体积在200 mm³后，将小鼠随机分为三组，分别为生理盐水组（Saline）、自由阿霉素药物组（free DOX）和载药胶束组（RMSM-DOX），每组十只。DOX剂量为5 mg/kg小鼠体重。五组小鼠分别通过尾静脉注射六次，每两天一次。在第一次注射后三十天内检测小鼠肿瘤的体积和重量。

检测：

取1 mL RMSM-DOX冷冻干燥，将冷冻干燥产物溶于1 mL二甲基甲酰胺（DMF）中，荧光光谱测定DOX的荧光强度，利用DOX在DMF中的标准曲线，计算DOX含量，通过所测结果得到荧光强度（F）与阿霉素浓度（c）的关系式为F=-183.1+438.8c。

药物负载率（DLC）和包封率（DLE）的计算公式如下：

DLC(wt%)=(载药量/载药胶束总质量)×100%；

DLE(%)=(载药量/初始投药量)×100%。

通过测定计算载药胶束组的DLC(wt%)为9.9%，DLE(%)为21.9%。