粘膜粘附性聚γ谷氨酸纳米胶束及利用其的药物载体的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和亲脂性化合物的复合物形成的纳米胶束，更详细而言，涉及一种由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和亲脂性化合物的复合物形成的纳米胶束及其制备方法和利用上述纳米胶束的粘膜粘附特性的药物载体。
【背景技术】
[0002]本发明涉及能够利用作为生物相容性天然高分子的聚γ谷氨酸来传递药物或荧光体的聚γ谷氨酸纳米胶束及其制备方法。药剂的给药途径中最常用的途径为口服给药，但在直接施用于粘膜部位而能够提高治疗效果的药品以及通过粘膜吸收对于提高生物体利用率的提高有效的药物的情况下，粘膜作为主要的替代给药途径而受到瞩目。粘膜以胃肠道等不露出在外部的部位为代表，存在于口腔、鼻腔、生殖器、直肠、消化器、皮肤溃疡部位等。向这些粘膜部位给药的生理活性物质与通常口服给药而被吸收的药物相比，具有能够被直接吸收到血流中从而药物表达所需要的时间短的优点。另外，在对于口腔、鼻腔、呼吸器官粘膜、眼粘膜、生殖器粘膜、皮肤溃疡部位来说，与口服给药相比，对病灶部位直接给药具有能够更好地提高药效的优点。
[0003]另外，由于粘膜周围集中了许多免疫细胞，因此将流行性感冒疫苗用抗原物质通过粘膜来进行传递，从而增强粘膜免疫性也是非常重要的。此时，如果被用作抗原载体的材质除了能够单纯地执行抗原的传递性的作用以外，还能够执行有助于免疫细胞的活化的疫苗佐剂物质的功能，则能够称其价值非常大。
[0004]作为粘膜粘附性高分子，一直以来较多地使用聚丙烯酸材质的物质。美国注册专利第4，292，299号中提出了利用聚丙烯酸及其衍生物与聚丙烯酸纤维素衍生物等的共聚物的粘膜粘附性药物体，在欧洲注册专利第654，261号中，为了获得粘膜粘附性而使用了纤维素醚衍生物、聚丙烯酸衍生物和明胶的物理性混合组合物。另外，美国注册专利第5，942，243号中，将聚苯乙烯作为基础成分的共聚物用作粘膜给药用药物传递制剂成分。但是，这些粘膜粘附性材质中的大部分是通过化学合成方法制备的有机合成物质。因此，基于具有生物体亲和性的来自生物体材质的粘膜粘附性载体的开发活跃地开展着。
[0005]作为用于形成粘膜的主要成分的粘蛋白是从动物的外分泌腺分泌的粘性物质的统称，指与糖类结合的复合蛋白质。该粘蛋白促进作为细胞的主要成分的蛋白质的消化，从而在体内起到有用的作用，并起到胃壁保护作用、解毒作用。该粘蛋白存在的器官为口腔、鼻腔、喉、胃肠道、眼睛、肛门、阴道，其厚度从数nm?170 μπι不等。粘蛋白网状的结构通过各种键来维持，其键有离子键、氢键、二硫键、范德华键、粘蛋白之间的交联等。对与这样的键连接的粘膜附着性高分子的研究活跃地开展着，主要以具有与存在于粘蛋白层的键相互作用较强的特征的高分子为主。已知，通常粘膜层具有复杂的多孔性网状结构，在数微米的大小的细菌的情况下，通常不能通过粘膜层，但在粘膜层崩塌的地方或薄处，一部分能够通过。在10纳米左右大小的抗体和比其大的质粒DNA的情况下，虽然能够通过粘膜层，但被存在于粘膜层的许多酶而分解，因此难以通过粘膜层。已知在200纳米以下大小的病毒的情况下，快速地通过粘膜层。
[0006]关于本发明中使用的聚γ谷氨酸，其作为具有羧基的多肽，申请了关于利用生产高分子量的聚γ谷氨酸的耐盐性菌株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)清国酱菌株(Chung kook jang)来生产聚γ谷氨酸的方法的专利(韩国注册专利第500796号)和含有聚γ谷氨酸的抗癌组合物、免疫强化剂、免疫调节剂、病毒感染抑制的专利(韩国注册专利第496606号，第517114号，第475406号，第0873179号)。另外，对物质的医药用途的研究在持续进行，持续地查明了多种功效。
[0007]对此，本发明人为了开发具有粘膜粘附特性的药物载体，进行例示的努力，结果确认了由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和亲脂性化合物的复合物形成的纳米胶束具有粘膜粘附特性和免疫强化效果以及将上述纳米胶束用作药物载体时向粘膜的药物传递效果高，从而完成了本发明。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于，基于作为来自生物体的天然高分子的聚γ谷氨酸，从而提供粘膜粘附性优异的纳米胶束及其制备方法。
[0009]本发明的另一目的在于，提供利用粘膜粘附性优异的纳米胶束的药物载体。
[0010]为了实现上述目的，本发明提供由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和亲脂性化合物的复合物形成的纳米胶束。
[0011]本发明还提供一种由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和亲脂性化合物的复合物形成的纳米胶束的制备方法，其包括以下步骤:(a)在聚谷氨酸溶液中混合亲脂性化合物-胺复合物溶液来制备聚谷氨酸-亲脂性化合物复合物的步骤；以及(b)用胺系化合物处理上述聚谷氨酸-亲脂性化合物复合物，从而用氨基取代聚γ谷氨酸的羧基，由此制备由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和亲脂性化合物的复合物形成的纳米胶束的步骤。
[0012]本发明还提供一种纳米胶束药物载体，其特征在于，在由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和亲脂性化合物的复合物形成的纳米胶束的内部封入有选自由蛋白质、基因、肽、化合物、抗原和天然物质组成的组中的药物。
【附图说明】
[0013]图1是示出根据本发明的实施例的粘膜粘附性聚γ谷氨酸-胆固醇纳米胶束(T -PGA nanomicelles)的化学结构式以及该纳米胶束所具有的病毒抗原载体的特性的原理概念图(a)，并且将该纳米胶束的粒径用DLS (b)和Cryo-TEM(C)显示。
[0014]图2示出小鼠模型中将注入到鼻腔内的粘膜粘附性聚γ谷氨酸-胆固醇纳米胶束的粘膜粘附性利用(a)SPECT/CT和(b)免疫组织荧光成像法(b)测定的影像。
[0015]图3是示出小鼠模型中将导入有模型抗原(OVA)的聚γ谷氨酸-胆固醇纳米胶束注入鼻腔内之后测定抗原特异性免疫功效的结果。(a)OVA-特异性IgG抗体反应的诱导能力测定(为了对比，比较示出了聚Y谷氨酸中只取代有如胆固醇那样的亲脂性基团的聚Y谷氨酸-胆固醇(γ-PGA-Cholesterol，表面为羧基)复合物的情况下出现的抗原特异性免疫反应)，(b) OVA-特异性IgA抗体反应的诱导能力测定，(c)示出对生成通过IFN-γ ELISpot验证的IFN-γ的细胞的个数进行测定的结果。(**，ρ〈0.01 ;***，ρ〈0.001，n.s.，不显著(not significant))。
[0016]图4是示出小鼠模型中将导入有流行性感冒病毒抗原的聚γ谷氨酸-胆固醇纳米胶束注入鼻腔内之后测定抗原特异性免疫功效的结果(1.PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)，2.仅PR8，3.PR8+聚γ谷氨酸-胆固醇纳米胶束(10 μ g)，4.PR8+聚γ谷氨酸-胆固醇纳米胶束(100 μ g)。(a)流行性感冒病毒特异性IgG抗体的生成测定，(b)流行性感冒病毒特异性IgA抗体的生成测定，(c)对生成通过IFN-γ ELISpot验证的IFN-γ的细胞的个数进行测定，(d)利用病毒抗体测定血凝素的血液凝集反应抑制功效，(e)施用疫苗后病毒感染的小鼠体重的变化，(f)示出对施用疫苗后病毒感染的小鼠的致死率的测定。(*，p〈0.05;**，ρ〈0.01 ;***，ρ〈0.001.n.s.，不显著)。
【具体实施方式】
[0017]从一个方面出发，本发明涉及由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和亲脂性化合物的复合物形成的纳米胶束及其制备方法。
[0018]本发明的由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和亲脂性化合物的复合物形成的纳米胶束通过以下步骤制备:
[0019](a)将聚谷氨酸溶液和亲脂性化合物-胺复合物溶液混合来制备聚谷氨酸-亲脂性化合物复合物的步骤；以及
[0020](b)将上述聚谷氨酸-亲脂性化合物复合物用胺系化合物处理，用氨基取代聚γ谷氨酸的羧基，从而制备由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和亲脂性化合物的复合物形成的纳米胶束的步骤。
[0021]本发明中，亲脂性化合物可以使用选自由胆固醇及其衍生物、具有碳数3?21个的脂肪族化合物(C3-C21)以及包含I?10个苯基的芳香族化合物组成的组中的化合物。
[0022]作为一个例子，亲脂性化合物中胆固醇系的特征在于，选自胆固醇(Cholesterol)、胆固醇 β -D-葡糖苷(Cholesterol β -D-glucoside)、胆留醇基N-(三甲基钱乙基)氨基甲酸酯氯化物(Cholesteryl N-(trimethyl ammon1ethyl)carbamate chloride)、胆留醇油醇碳酸酯(Cholesteryl oleyl carbonate)、胆留烧醇(Cholestanol)、羊毛甾醇(Lanosterol)、安妥明(Clofibrate)、胆甾醇油酸酯(Cholesteryl oleate)、美伐他汀(Mevastatin)、疏基胆固醇(Th1cholesterol)、豆留烧醇(Stigmastanol)、胆留醇棕榈酸酯(Cholesteryl palmitate)、二乙基伞形酮磷酸酯(Diethylumbelliferylphosphate)、胆固醇十七烧酸酯(Cholesteryl heptadecanoate)、
谷甾醇(β-Sitosterol)、5 α -胆甾烧(5 a-Cholestane)、5-胆甾稀 _3_ 酮(5-Cholesten-3-one)等胆固醇及其化合物和衍生物。
[0023]亲脂性化合物中生育酚系的特征在于，其选自(±)_α -生育酚((±) - a -Tocopherol)、(+) - δ -生育酸((+) - δ -Tocopherol)、DL- α -生育酸醋酸酯(DL- a -Tocopherol acetate)、(+) - y -生育酸((+)_ y -Tocopherol)、维生素 E 醋酸酯(Vitamin E acetate)、短叶松素(Pinobanksin)、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate)、视黄醇乙酸酯(Retinyl acetate)等由10?100余个的碳形成的生育酸及前体、衍生物化合物。
[0024]亲脂性化合物中脂肪族(aliphatic)化合物可以选自包括丙炔(Propyne)、丙稀醛(Acrolein)、丙稀醇(Allyl alcohol)、稀丙硫醇(2-Propene-l_th1