N‑氨甲酰谷氨酸在缓解鸡非酒精性脂肪肝病症中的应用的制作方法

本发明属于生物医学和新药研究领域，具体涉及一种n-氨甲酰谷氨酸在缓解鸡非酒精性脂肪肝病症中的应用。

背景技术：

医学上将由慢性应激诱导发生的脂肪肝归为非酒精性脂肪肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，nafld)，属于继发性nafld。nafld是一种获得性、代谢应激性肝损伤，属于代谢综合征的范畴，以肝细胞内的脂类堆积为特征，一般可以从相对良性和轻微的脂肪变性发展到更为严重的非酒精性脂肪性肝炎，继而发展到肝硬化和肝癌，严重时可能会导致肝功能衰竭。nafld的发生诱因较为复杂，其发生机制尚未明了，而脂肪在肝脏中的异位沉积是发生脂肪性肝炎的前提条件。脂肪肝发病呈全球化流行的趋势。nafld已成为发达国家和中国富裕地区慢性肝病的首要病因，其发病率仍在增加且有低龄化发病趋势。因此，nafld的发病危险因素和临床特征引起学界关注。

目前，nafld的治疗对策除了防治原发病或相关危险因素外，一是针对饮食结构不良开展基础治疗，制定合理的能量摄人以及饮食结构调整、中等量有氧运动、纠正不良生活方式和行为；一是针对伴随病症，如肥胖、胰岛素抵抗和高血脂等，适当药物和手术减肥，施以胰岛素增敏剂和降血脂药物；二是针对nafld伴肝功能异常、代谢综合征、经基础治疗3-6个月仍无效，以及肝活体组织检查证实为nash和病程呈慢性进展性经过者，可以进行药物辅助治疗，以抗氧化、抗炎、抗纤维化，可依药物性能以及疾病活动度和病期合理选用。但是，一方面慢性进展性经过者不宜同时应用多种药物，治疗带来体重急剧下降和滥用药物及其他可能诱发肝病恶化的因素，可能加重肝脏损害；另一方面上述治疗对nafld急性进展性经过者可能效果不显著。

在慢性应激状态下，动物下丘脑-垂体-肾上腺轴被激活，大量的糖皮质激素(glucocorticoids，gcs)释放到血液，作用于全身各处的靶细胞，调控细胞的增殖与凋亡、物质代谢与能量平衡、氧化应激与免疫反应，对应激状态下机体稳态的维持和应变过程中起关键作用。故gcs是动物应激发生的标记物，同时也被称为稳态调节因子。因此，糖皮质激素，包括鸡皮质酮和人工合成的糖皮质激素药物地塞米松，被运用于建立动物的慢性应激模型，并用以对比研究目标性状形成的内在机制。研究发现，提高啮齿类和家禽外周循环中皮质酮(corticosterone，cort)水平，会导致脂类在肝脏和外周组织的异常沉积。因此，糖皮质激素诱导建立的动物慢性应激模型，可用以开发防治nafld药物和筛选经济、安全、有效的抗慢性应激调节剂。n-氨甲酰谷氨酸(n-carbamylglutamate，ncg)已在人类医学丙二酸尿症的治疗和哺乳动物生长、繁殖上开展了一些应用研究。但是，ncg作为nafld治疗药物、抗慢性应激调节剂使用的相关研究尚未见报道，亦没有在鸟类和家禽上应用的相关研究报道。

技术实现要素：

为了解决以上技术问题，本发明首次将n-氨甲酰谷氨酸应用在缓解鸡非酒精性脂肪肝行病症。

本发明提供了一种n-氨甲酰谷氨酸在缓解鸡非酒精性脂肪肝病症中的应用。

进一步的，非酒精性脂肪肝病症是由皮质酮诱导形成的。

进一步的，n-氨甲酰谷氨酸缓解鸡非酒精性脂肪肝病症呈现剂量依赖性。

进一步的，将n-氨甲酰谷氨酸添加到鸡饲料中用于缓解鸡非酒精性脂肪肝病症。

进一步的，，n-氨甲酰谷氨酸在鸡饲料中的添加的质量比例为0.05-0.2％

进一步的，n-氨甲酰谷氨酸在鸡饲料中的添加量为0.05-0.2％。

进一步的，鸡饲料包含以下质量百分含量的组分：玉米58.8-67.04％、豆粕20.14-30.5％、玉米蛋白粉0-5％、大豆油1.42-4.36％、石粉1.2-1.34％、磷酸氢钙0.88-1.33％、蛋氨酸0.08-0.18％、赖氨酸硫酸盐0.36-0.45％、苏氨酸硫酸盐0.01-0.05％、氯化钠0-0.3％、氯化胆碱0-0.3％、金霉素0-0.1％、微量元素0-0.2％、维生素0-0.03％。

进一步的，赖氨酸硫酸盐中赖氨酸的质量含量为65％。

进一步的，苏氨酸硫酸盐中苏氨酸的质量含量为98％。

本发明的有益效果为：本发明是首次将n-氨甲酰谷氨酸应用在缓解鸡非酒精性脂肪肝病症；n-氨甲酰谷氨酸可以极显著地缓解cort诱导的肝脏脂肪变性，具有剂量依赖效应；并且，在缓解脂肪肝的同时，对动物体重的影响不显著，符合nafld的用药标准。

附图说明

图1为本发明对照组和试验组中试验鸡的肝脏的表型；

图2为本发明对照组和试验组中试验鸡的肝脏组织切片的oil-red染色情况；

图3为本发明对照组和试验组中试验鸡的体重情况；

图4为本发明对照组和试验组中试验鸡的腹部脂肪带宽度；

图5为本发明对照组和试验组中试验鸡的肝脏指数；

图6为本发明对照组和试验组中试验鸡的血浆中的tg含量；

图7为本发明对照组和试验组中试验鸡的肝脏中的tg含量；

图8为本发明对照组和试验组中试验鸡的骨骼肌中的tg含量。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细地解释说明。

本发明开发出的一种n-氨甲酰谷氨酸缓解非酒精脂肪肝的动物模型，仅选择代表性的试验说明n-氨甲酰谷氨酸缓解非酒精脂肪肝的功效：

(1)构建n-氨甲酰谷氨酸添加动物模型

1)配制n-氨甲酰谷氨酸添加日粮：①在对应黄羽肉鸡生长期的日粮的配制过程中，将n-氨甲酰谷氨酸和日粮核心料(如表1所示)充分混合；②将①与日粮原料(如表1所示)充分混合，然后制粒，得到含量为0.1％和0.2％的两种n-氨甲酰谷氨酸添加日粮饲料，装袋后保存于避光干燥处待用。

2)试验设计：试验动物分为3组，1个对照组(c)从育雏期(0-21天)开始饲喂不含n-氨甲酰谷氨酸的基础日粮，2个试验组，1个试验组(n1)从育雏期开始饲喂n-氨甲酰谷氨酸含量为0.1％的n-氨甲酰谷氨酸添加日粮，另1个试验组(n2)从育雏期开始分别饲喂n-氨甲酰谷氨酸含量为0.2％的n-氨甲酰谷氨酸添加日粮；饲喂至27日龄时，鸡只平均体重为0.61kg。

表1黄羽肉鸡饲料配方

(2)构建动物非酒精性脂肪肝模型

1)配制皮质酮溶液：

①确定待注射鸡只数为52只，待注射鸡平均体重为0.610kg，按照每只鸡每天注射皮质酮4mg/kg计算，每天共需要52只×0.610kg/只×4mg/kg＝126.88mg；用10ml灭菌带盖离心管将皮质酮分装7管，每管126.88mg×1.1＝139.57mg，保存于4℃待用；

②每天注射前，向盛有皮质酮的离心管加入8ml乙醇，充分溶解，制成皮质酮浓度为17.45mg/ml的纯酒精母液；取上述液体4ml放入一个50ml灭菌带盖离心管，然后用生理盐水稀释到总体积25ml×1.1＝27.5ml，制备成乙醇溶液浓度为16％的工作液，其中皮质酮浓度为2.536mg/ml，保存于4℃待用；间隔8-12h后，在当天第二次注射前按上法将剩下的4ml母液配置成为工作液，保存于4℃待用。

现有的溶解皮质酮的溶剂为玉米油，一般试验动物体重为0.5kg以上，故玉米油作为佐剂使用量达到0.4ml以上。而玉米油是一种营养复合型油剂，成分不稳定，且这种溶剂对动物的发育有干涉作用，会给试验带来不定因素，也会影响重复试验的稳定性。一般用玉米油作为溶剂的试验，必须设置两个对照组，即1个空白对照组和1个玉米油对照组；并且，动物注射部位局部吸收时间较长，也影响试验结果的准确性。本发明选择采用生理盐水稀释皮质酮母液，试验只需设置一个生理盐水对照组，节省了试验成本和工作量，且将试验动物因佐剂所受的影响降至最低。

本发明采用生理盐水稀释皮质酮母液，因为皮质酮在有机溶剂中才能溶解，而且溶解度很小，直接用生理盐水或10-20％酒精溶液无法溶解。所以为了解决这个矛盾，本发明采用的梯度稀释法，先将皮质酮溶解于纯酒精中制成母液，然后用生理盐水稀释，最终能将皮质酮很好地溶解。

本发明采用的梯度稀释法，先将皮质酮溶解于纯酒精中制成母液，然后用生理盐水稀释，由于皮质酮在10-20％酒精溶液中长时间放置容易析出，故必须在注射前临时小体积配制。

2)构建模型：

①将(1)-2)中的3组试验动物(对照组c、试验组n1、试验组n2)，一分为二(c-con、c-cort、n1-con、n1-cort、n2-con、n2-cort)，对动物颈部局部消毒，消毒后将c-cort、n1-cort、n2-cort三组试验动物向皮下注射步骤1)中②的cort工作液，注射量为4mg/kg体重，每天分2次注射，间隔8-12h；c-con、n1-con、n2-con三组试验动物注射16％的酒精溶液，注射量为1.58ml/kg体重，每天分2次注射，间隔8-12h。

②按照1)中②的方法配制工作液，连续注射7天，至34日龄，对试验动物的脂肪肝表型进行检测。

(3)n-氨甲酰谷氨酸缓解非酒精脂肪肝的功效检测

1)如附图1-2所示，其中c-cort组肝色比其他组的肝色黄，肝脏组织切片通过oil-red染色后，可见c-cort组肝细胞中沉积有大量的脂质颗粒，说明皮下注射cort成功构建了肉鸡脂肪肝模型；其中n1-con、n2-con组的肝色、组织切片与c-con组的相比差异不大，而n1-cort、n2-cort组与c-cort组的相比，肝色逐渐变浅，肝细胞中沉积的脂质颗粒也逐渐减少，说明n-氨甲酰谷氨酸缓解cort诱导非酒精脂肪肝呈现剂量效应。

2)c-cort试验组与对照组(c-con)相比，仅7天时间试验鸡(c-cort)的体重就极显著低于对照组(如附图3所示)，皮下脂沉积显著增加(如附图4所示)；肝脏肿大、脂类沉积极显著增加(如附图5所示)，血液、肝脏和骨骼肌的甘油三酯tg含量均显著增加(如附图6、7、8所示)；n-氨甲酰谷氨酸能显著缓解cort诱导的肉鸡脂肪肝病症(如附图1、2所示)，在缓解肝脏指数、皮下脂沉积的情况下(如附图4、5所示)，显著降低血液、肝脏和骨骼肌的tg含量(如附图6、7、8所示)。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。