表面展示谷氨酸脱氢酶的重组芽孢及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体设及一株表面展示谷氨酸脱氨酶的重组芽抱 及其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002] 氨基下酸是一种抑制人体神经信息传递的非天然氨基酸，具有加强葡萄糖憐 酸醋酶的活性，促进脑细胞代谢的作用。同时，L-2-氨基下酸也是一种重要的化工原料和很 多药物合成的手性中间体，已被广泛用于药物合成，例如，它是抗癒痛药物左乙拉西坦和布 瓦西坦的关键生产原料，也是抑菌抗结核药乙胺下醇盐酸盐的关键手性前体。因此，大量生 产心2-氨基下酸可W降低运些疾病治疗的成本，同时提高其高效性和安全性。根据文献报 道，经过定点突变K92V和T195S的新型谷氨酸脱氨酶能在辅因子NADPH的存在下作用于产k 2-氨基下酸的代谢过程。
[0003 ]芽抱表面展示技术是新近发展起来的一口基因操作技术。芽抱是枯草芽抱杆菌在 营养缺乏等逆境条件下，营养细胞分化形成的休眠体。由于芽抱的特殊结构，使其能忍耐一 些极端环境如高溫、高压、化学药物等。实现芽抱表面展示技术的关键是需要一种高丰富 度、表面结合能力强的芽抱衣壳蛋白。外层的芽胞衣壳主要由疏水的衣壳蛋白构成，具有抗 酶解、抗药物功能。目前已报道被成功应用的芽抱衣壳蛋白如CotB、CotC、CotG和CotX，都是 来源于外层。从现有的文献报道来看，CotB和CotC常用于错定抗原制备疫苗，而CotG则错定 酶蛋白发挥全细胞催化剂功能。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是，提供一株表面展示谷氨酸脱氨酶的重组芽抱。
[0005] 本发明还要解决的技术问题是，提供上述表面展示谷氨酸脱氨酶的重组芽抱的构 建方法。
[0006] 本发明最后要解决的技术问题是，提供上述表面展示谷氨酸脱氨酶的重组芽抱在 产心2-氨基下酸中的应用。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[000引表面展示谷氨酸脱氨酶的重组芽抱，其特征在于，该重组芽抱导入了表达枯草芽 抱杆菌的错定蛋白CotG基因与谷氨酸脱氨酶G畑2基因，
[0009] 所述的错定蛋白CotG基因的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示;所述的谷氨酸脱氨 酶GD肥基因的核巧酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0010] 其中，错定蛋白CotG基因的N端为CotG基因的启动子，所述的CotG基因的启动子， 其核巧酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0011] 其中，错定蛋白CotG基因与谷氨酸脱氨酶G畑2基因之间的连接区域的氨基酸序列 如沈Q ID NO:4所示。
[0012] 上述表面展示谷氨酸脱氨酶的重组芽抱的构建方法，包括如下步骤：
[0013] (1)将沈Q ID N0:3、沈Q ID N0:1、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列 依次连接，得到整合片段Co tG-g化A;
[0014] (2)将整合片段CotG-g化A克隆到pEB03质粒的多克隆位点处，得到重组质粒 祀B03-CotG-g化2;
[0015] (3)将重组质粒pEB03-CotG-g化A转化至枯草芽抱杆菌WB600,得到重组枯草芽抱 杆菌祀B03-CotG-GD肥；
[0016] (4)将步骤(3)得到的重组枯草芽抱杆菌在GYS培养基中培养，使其产生芽抱，然后 收集菌体，用溶菌酶裂解，得到表面展示谷氨酸脱氨酶的重组芽抱。
[0017] 步骤(2)中，所述的祀B03质粒，其核巧酸序列如沈Q ID N0:5所示
[0018] 步骤(4)中，将重组枯草芽抱杆菌在GYS培养基中，37°C培养2地，然后离屯、收集菌 体，菌体用lOOmM的P册.0憐酸盐缓冲悬浮，用50mg/L的溶菌酶在37°C裂解比，然后1200化pm 离屯、30min，沉淀用含有Imol/L NaCl、lmol/L KC1和的0.1mol/L、p册.0憐酸盐缓充液冲洗， 即可得纯化的表面展示谷氨酸脱氨酶的重组芽抱。
[0019] 具体的重组枯草芽抱杆菌的构建方法如下：
[0020] ( 1 ) W大肠杆菌谷氨酸棒杆菌的基因组为模板，F-GDH(BamHI ): CGCGGATCCATGGATCAGACATATTCTCTGGAGT;R-GDH()(hoI):CCGCTCGAGTAAATCACACCCTGCGCCAGC 为引物，扩增得到谷氨酸脱氨酶，该基因片段全长1344bp，编码蛋白包含447个氨基酸，通过 基因突变，将第92位氨基K酸突变为V，第195为氨基酸T突变为S，得到gdM片段； 陶](2)WBacillus subtilis 168基因组为模板，cotG-F: GTCGACGGTATCGATAAGCTTAGTGTCCCTAGCTCCGAG，cotG-R: TGAACCCCCACCTCCTTTGTATTTCTTTTTGACTACCCAG为引物，扩增得到错定蛋白CotG基因及启动 子片段；
[0022] (3)将谷氨酸脱氨酶G畑2的基因片段连接到错定蛋白CotG基因的C端，得到整合片 段CotG-g化A，将CotG-g化A片段克隆到祀B03质粒上，得到重组质粒祀B03-CotG-g化A;
[0023] (4)将重组质粒pEB03-CotG-g化A转化枯草芽抱杆菌WB600,得到重组芽抱杆菌 pEB03-CotG-GDH2 〇
[0024] (5)芽抱的纯化:将含有重组质粒的B. subtilis WB600在37°C条件下，用GYS培养 基（（NH4)2S04 2g/L、酵母膏2g/L、K2HP04 0.5g/L、葡萄糖lg/L、MgS04 0.41g/L、CaC12地20 0.08g/L、MnS04*甜20 0.07g/L)培养24h，然后离屯、收集菌体。菌体用lOOmM的P册.0憐酸盐 缓冲悬浮，用〇.5%的溶菌酶在37°(3裂解化，然后1200化9111离屯、3〇111111，随后用謹化(：1，11 KC1和憐酸酸盐缓冲冲洗，即可得纯化的芽抱细胞，
[0025] 上述表面展示谷氨酸脱氨酶的重组芽抱的构建方法构建得到的表面展示谷氨酸 脱氨酶的重组芽抱在制备氨基下酸中的应用。
[0026] 催化体系如下：取Ig纯化后重组芽抱加入100ml催化反应液（O.lmol/L pH 8.0PBS，0.2mol/L 酬下酸，0.2mol/L NH4Cl，0.2Xl〇-2mol/L NADPH)
[0027] 催化条件如下:溫度37°C，260rpm，时间12h。离屯、留取上清。
[002引有益效果：
[0029]本发明在枯草芽抱杆菌WB600中表面展示谷氨酸脱氨酶，构建并筛选得到一株重 组芽抱杆菌，此重组芽抱上错定的谷氨酸脱氨酶蛋白发挥全细胞催化剂功能，Wa-酬下酸 为底物，催化生产レ2-氨基下酸，发酵液中氨基下酸的浓度可达38.72g/L，转化率为 95.6%。枯草芽抱杆菌是GRAS菌种之一，因此它产生的芽抱是无毒的，同时操作简单，稳定 性好，安全性高;并且氨基下酸的产量较高，底物转化率高，发酵工艺简单高效，没有副 产物，易于分离，且易于工业化大生产，具有良好的产业化应用前景。
【附图说明】
[0030]图1谷氨酸脱氨酶基因的PCR图。
[0031 ]图2谷氨酸脱氨酶基因与T载体连接后提取质粒与酶切验证图。
[0032] 图3谷氨酸脱氨酶基因与祀T-28a载体连接后提取质粒与酶切验证图。
【具体实施方式】
[0033] 根据下述实施例，可W更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0034] 实施例1:谷氨酸脱氨酶基因的克隆与表达。
[0035] (1)谷氨酸脱氨酶基因片段扩增：
[0036] 扩增谷氨酸脱氨酶引物如下：
[0037] F-GDH(BamH I)：CGCGGATCCATGGATCAGACATATTCTCTGGAGT
[0038] R-G畑（Xho I):CCGCTCGAGTAAATCACACCCTGCGCCAGC
[0039] W谷氨酸棒杆菌基因组大肠杆菌DH5a基因组为模板，扩增的目的片段全长 1344bp，该基因编码蛋白包含447个氨基酸。图为PCR之后所得到的产物，再进行切胶回收目 的片段，如图1所示。
[0040] (2)目的片段与T-载体连接转化并进行双酶切(BamH I和EcoR I)验证：
[0041] PCR获得的谷氨酸脱氨酶基因片段与T-载体连接，转化大肠杆菌，W质粒小提试剂 盒提取质粒，双酶切鉴定并进行琼脂糖凝胶电泳，双酶切电泳图显示有两条带，通过酶切位 点分析，证实片段成功插入到载体(图2)。
[0042] (3)测序正确后，酶切下片段与载体祀T-28a连接转化提质粒并进行酶切验证：
[0043] 含目的基因的T载与载体PET-2&1分别经BamH I和趾0 I双酶切，胶回收的目的基 因片段与线性化的载体连接，转化成功后提质粒进行酶切验证连接成功(图3)。
[0044] (4)选出连接成功的一管样品祀T-28a-GDH送金唯智公司定点突变为将第92位氨 基K酸突变为V，第195为氨基酸T突变为S，得到祀T-28a-GD肥质粒。
[0045] (5)酶活检测：
[0046] 蛋白表达：
[0047] 酶切鉴定正确后，将祀T28a-GDH2重组质粒转化至表达宿主E.coli Rosetta(DE3) 感受态细胞，涂布于LBAKan+cl)抗性平板培养过夜。从平板中挑取单菌落于5ml LB中37°C 200巧m培养过夜（由于Rosetta具有Cl抗性，pET-28a具有kan抗性，为保证质粒不丢失，液体 培养基中均加入千分之一的α和Kan抗性）。按照1 %的量转接入200ml LB液体中，同时加入 抗生素，37°C200巧m培养至0D = 0.8左右加入0.4mM IPTG，30°C200巧m诱导lOh，集菌。
[004引粗酶液的获得：
[0049] 用lOOmmol/L P册.0的化is-HCl缓冲将菌泥洗两遍，具体操作为：用缓冲将菌泥重 悬，700化pm 5min，重复一遍。用10ml缓冲重悬，超声（超3秒，停5秒，60次），4°C离屯、15min， 取上清，即获得的粗酶液。
[0050] 酶纯化：
[0051] A、将树脂中的20%的乙醇从纯化管下方滴出；
[0化2] B、用10ml超纯水过柱子；
[0053] C、用10ml 500mM咪挫过柱子（目的是洗去上一个人未洗下来的蛋白）；
[0054] D、10ml Tris-HCl缓冲过柱子；
[0化日]6、重复0;
[0056] F、加粗酶液、摇晃、重悬，将柱子在冰上放置30min左右后弃酶液；
[0057] G、10ml 20mM咪挫洗涂，洗3-4次，在最后快洗完的时候接一管测蛋白浓度；
[0化引 H、2ml 500mM咪挫洗脱蛋白，用5ml离屯、管接住；
[0059] I、用10ml 500mM咪挫继续洗去剩余蛋白，洗2次；
[0060] J、用10ml 20%的乙醇保存。
[0061] 蛋白鉴定：
[0062] 取上清液20化按比例加入2 X SDS-PAGE上样缓冲液，重悬菌液，煮沸5~lOmin，进 行SDS-