专利名称：谷氨酸浓度的测定方法及谷氨酸诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药、食品、环境等领域内对谷氨酸浓度的检测，尤其涉及利用酶比色法测定谷氨酸浓度的方法，以及由此制得的谷氨酸诊断试剂盒，属于谷氨酸浓度分析检测技术领域。
背景技术：
中国GB5009-2003味精卫生标准分析方法有①旋光计法，②甲醛滴定法，③凯氏定氮法。味精系指以粮食及制品为原料经发酵提纯的谷氨酸钠。
酶法分析是国际上公认的谷氨酸盐的分析方法，已被多个国际权威组织或机构采纳如IFU(国际果汁生产者协会)，AIJN(欧盟果蔬汁及饮料生产者联盟)，及MEBAK、OICC、VDLUFA等组织广为推崇，并确定为标准检测方法。已被写入澳大利亚，荷兰，德国，瑞士等多个国家的食品法。国内也有数家果汁、酒类加工企业使用酶法试剂盒作为检测标准。
生物体内存在分解骨质的破骨细胞和形成骨骼的成骨细胞，正常情况下两种细胞的作用保持着良好的平衡。如果平衡被打破、破骨细胞过于活跃，就会导致骨质疏松。破骨细胞中含有谷氨酸，而一种名为“谷氨酸转运体”的蛋白可以将谷氨酸排出破骨细胞，被“释放”的谷氨酸会和细胞表面的受体结合，激活细胞内的酶，抑制破骨细胞分解骨质的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定谷氨酸浓度的方法，以及应用该方法配制而成的谷氨酸诊断试剂盒。
为实现本发明的目的，一种酶比色法测定谷氨酸浓度的方法，利用谷氨酸脱氢酶为作用酶和显色酶，对待测样品中的谷氨酸进行检测，采用以下步骤进行首先，将测定的样品与含有辅酶、谷氨酸脱氢酶及水的试剂混匀，使之发生以下反应，
然后，将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出谷氨酸的浓度大小。
实现本发明谷氨酸诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成缓冲液 20～500mmol/L，稳定剂 1～4000mmol/L，辅酶1～6mmol/L，谷氨酸脱氢酶1000～80000U/L。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，比如
双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分辅酶可以放在试剂II；试剂II中的谷氨酸脱氢酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II当中通常加入稳定剂，浓度在1～4000mmol/L或0.1％～100％体积比范围之内。
无论是单剂还是双剂，辅酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。
用作稳定剂的物质可以是硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一种。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂还是双剂，如下配方成分关系的诊断/检测试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案缓冲液 100mmol/L，稳定剂 500mmol/L辅酶3mmol/L，谷氨酸脱氢酶18000U/L。
利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定谷氨酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的谷氨酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行谷氨酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本发明完全利用酶比色法测定谷氨酸浓度，测试结果准确；(2)参与反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中谷氨酸浓度的大小；(6)本发明提供的液态谷氨酸诊断/检测试剂盒，稳定性好，很好地保证了应用测试效果。配成双剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。
具体实施例方式
本发明一种酶比色法测定谷氨酸浓度的方法及谷氨酸诊断试剂盒，运用谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase；EC 1.4.1.2；EC 1.4.1.3)酶促反应速率比色法/终点法。谷氨酸脱氢酶酶解谷氨酸，同时将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸光度上升的程度/速度，可以测算谷氨酸的浓度大小。
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)按以下成分和用量配制谷氨酸诊断试剂盒三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，硫酸铵 500mmol/L，NADP+3mmol/L，谷氨酸脱氢酶 18000U/L；
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测谷氨酸样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为正反应(上升反应)，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出谷氨酸的浓度大小。
实施例二(双剂)按以下成分和用量配制谷氨酸诊断试剂盒试剂I——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，甘油 50mmol/L，NAD+3mmol/L；试剂II——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，乙二醇 500mmol/L，谷氨酸脱氢酶 18000U/L；试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测谷氨酸样品与试剂I、试剂II的体积比例为2∶20∶5，反应方向为正反应(上升反应)，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出谷氨酸的浓度大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外源物质的污染，便于推广应用。
权利要求
1.谷氨酸浓度的测定方法，其特征在于包括以下步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出谷氨酸的浓度大小。
2.谷氨酸诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成缓冲液 20～500mmol/L，稳定剂 1～4000mmol/L，辅酶1～6mmol/L，谷氨酸脱氢酶1000～80000U/L。
3.根据权利要求2所述的谷氨酸诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为硫酸铵、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的谷氨酸诊断试剂盒，其特征在于所述辅酶是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。
5.权利要求2～4中任意一种谷氨酸诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂或者双剂。
6.权利要求2～4中任意一种谷氨酸诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒为干粉试剂盒或液体试剂盒。
全文摘要
本发明涉及一种酶比色法测定谷氨酸浓度的方法及谷氨酸诊断试剂盒，运用谷氨酸脱氢酶酶促反应速率比色法/终点法。谷氨酸脱氢酶酶解谷氨酸，同时将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸光度上升的程度/速度，可以测算谷氨酸的浓度大小。该方法特异性高，不受内、外源物质的污染，测试结果精确、准确性好。将诊断试剂盒制成双剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性。本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果，便于推广应用。
文档编号G01N33/50GK101082572SQ20071002476
公开日2007年12月5日 申请日期2007年6月28日 优先权日2007年6月28日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司