专利名称：谷氨酸诊断/测定试剂盒及谷氨酸浓度的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种谷氨酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定谷氨 酸浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
技术背景中华人民共和国国家标准GB5009-2003味精卫生标准分析方法有1. 旋光计法2.甲醛滴定法3.凯氏定氮法。味精系指以粮食及制品为原料经发 酵提纯的谷氨酸钠。酶法分析是国际上公认的谷氨酸盐的分析方法，已被多个国际权威组织 或机构采纳如IFU (国际果汁生产者协会)，AIJN (欧盟果蔬汁及饮料生 产者联盟)，及MEBAK，OICC,VDLUFA等组织广为推崇，并确定为标准 检测方法。已被写入澳大利亚，荷兰，德国，瑞士等多个国家的食品法。 国内也有数家果汁、酒类加工企业使用酶法试剂盒作为检测标准。生物体内存在分解骨质的破骨细胞和形成骨骼的成骨细胞，正常情况下 两种细胞的作用保持着良好的平衡。如果平衡被打破、破骨细胞过于活跃， 就会导致骨质疏松。破骨细胞中含有谷氨酸，而一种名为"谷氨酸转运体" 的蛋白可以将谷氨酸排出破骨细胞，被"释放"的谷氨酸会和细胞表面的受 体结合，激活细胞内的酶，抑制破骨细胞分解骨质的作用。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续 监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得 以测定谷氨酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的谷氨 酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自 动生化分析仪上进行谷氨酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而 可以得到切实的推广应用。本发明谷氨酸浓度测定方法原理如下L-谷氨酸+氧+水谷氨酸氧化酶氨离子+2-酮戊二酸酯+过氧化氢过氧化氢+辅酶 NAIXP)H氧化酶 还原型辅酶+氧 这种方法应用谷氨酸氧化酶(glutamate oxidase; EC 1.4.3.7; EC 1.4.3.11) 偶联NAD(P)H氧化酶(NAD (P) Hoxidase; EC 1.6.3.1)酶促反应速率比 色法/终点法。谷氨酸氧化酶酶解谷氨酸反应产生过氧化氢，再通过偶联 NAD(P)H氧化酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为 还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm 处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸光度上升的程度/速度， 可以测算谷氨酸的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明谷氨酸诊断/测定试剂 盒较为理想缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L辅酶 3 mmol/L谷氨酸氧化酶 10000 U/LNAD(P)H氧化酶 12000 U/L本发明的谷氨酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶。 试剂2缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶。 辅酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可 以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制 成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶。 试剂2缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶。辅酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的 位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定谷氨酸浓度的方法，其辅酶可 以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的谷氨酸诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 500mmol/L 辅酶 3 mmol/L谷氨酸氧化酶 10000 U/LNAD(P)H氧化酶 12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用 前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间10分钟，起始吸光 度《0.1,测试主波长340nm,测试副波长405nm,被测谷氨酸样品与试 剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0 分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出谷氨酸的浓度大小。 实施例二本实施例的谷氨酸诊断/测定试剂为双试剂，包括: 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂辅酶100mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂谷氨酸氧化酶腦mmol/L 500 mmol/L 10000U/LNAD(P)H氧化酶 12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测谷氨酸样品与试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出谷氨酸的浓度大小。实施例三本实施例的谷氨酸诊断/测定试剂为三试剂，包括:试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂辅酶试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L100mmol/L 500 mmol/L 12000U/LNAD(P)H氧化酶 试剂3三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L10000U/L:试剂，可以直接使用。谷氨酸氧化酶 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体」测定谷氨酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C,反应时 间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测谷氨酸样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方 向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出谷氨酸的浓 度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种酶比色法及酶联法的谷氨酸的浓度测定方法，其方法原理如下L-谷氨酸+氧+水谷氨酸氧化酶氨离子+2-酮戊二酸酯+过氧化氢过氧化氢+辅酶NAD(P)H氧化酶还原型辅酶+氧将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出谷氨酸的浓度大小测定结果。
2. —种谷氨酸诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——500 mmol/L稳定剂 1——4000mmol/L辅酶 1- 6 mmol/L谷氨酸氧化酶 1000——80000 U/LNAD(P)H氧化酶 1000——80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述谷氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶组成单剂 试剂。
4. 根据权利要求2所述谷氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶组成双剂 试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶组成；试剂2,由缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶组成。辅酶、谷氨酸氧化酶、 NAD(P)H氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述谷氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶组成多剂 试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳 定剂、NAD(P)H氧化酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化 酶组成。辅酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶在试剂1、试剂2或试 剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述谷氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳 定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的谷氨酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定谷氨酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出谷氨酸的浓度大小。
文档编号C12Q1/00GK101324571SQ20071002339
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司