一种nadp磷酸酶活性测定试剂盒及其方法

一种nadp磷酸酶活性测定试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生命科学领域领域，涉及一种试剂盒，具体涉及一种NADP磷酸酶活性 测定试剂盒及其方法。
【背景技术】
[0002] NADP磷酸酶主要存在于植物组织中，是生物体内唯一催化NADP+降解为NAD+的酶， 与NADK-起调控NAD和NADP之间的平衡。
[0003] 目前已有两种NADP磷酸酶活性的测定方法，一种是通过乙醇脱氢酶循环测定NAD 变化，另一种是通过孔雀绿定磷法测定NAD变化。通过乙醇脱氢酶循环测定NAD变化的方法 需要严格控制反应的温度和时间，反应条件不易控制，试剂成本较高。孔雀绿定磷法适用于 测定磷浓度在〇. 〇6-2yg范围内的样品，若样品中NADP磷酸酶催化产生的磷含量过高则需要 稀释后测定。而且测定过程需要做预实验，以确定样本中NADP磷酸酶活性产生的无机磷是 否超过了测定范围，较为繁琐。

【发明内容】

[0004] 为了克服现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种NADP磷酸酶活性测定试剂盒及其 方法，可快速准确的计算出NADP磷酸酶活性。
[0005] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现： 一种NADP磷酸酶活性测定试剂盒，包括以下试剂： 提取液，1瓶，4 °C保存，由蔗糖、EDTA、牛血清白蛋白和苯甲基磺酰氟溶于Tr i s-HCl缓冲 溶液后配制而成，置于60mL试剂瓶中； 试剂一，液体X 1瓶，4°C保存，由Tris溶于水与冰乙酸的混合液后配制而成，置于30mL 试剂瓶中； 试剂二，粉剂X 5支，-20 °C保存，均由NADP组成，置于lmL离心管中； 试剂三，粉剂X 1瓶，4°C保存，由抗坏血酸组成，置于25mL试剂瓶中； 试剂四，粉剂X 1瓶，4°C保存，由钼酸铵组成，置于25mL试剂瓶中； 试剂五，液体X 1瓶，室温保存，由浓硫酸与水混合而成，置于25mL试剂瓶中； 试剂六，10mmol/L标准磷贮备液X 1瓶，4°C保存，由Na2HP〇4 · 12H20溶于水后配制而成， 置于10mL试剂瓶中。
[0006] 进一步的，所述提取液中，Tr iS-HC1缓冲溶液的浓度为50mmo 1/L，pH=7.4，体积为 60mL，鹿糖的质量为5. lg，EDTA的质量为52.6mg，牛血清白蛋白的质量为0.3g，苯甲基磺酰 氟的质量为lmg; 进一步的，所述试剂一中，Tris的质量为0.182g，Tris溶于水后与冰乙酸的混合液的pH =5.5，体积为3〇1^; 进一步的，所述试剂二中，每支离心管内的NADP的质量均为5.5mg; 进一步的，所述试剂三中，抗坏血酸的质量为2.5g; 进一步的，所述试剂四中，钼酸铵的质量为〇.625g; 进一步的，所述试剂五中，浓硫酸的体积为3.47mL，水的体积为21.53mL; 进一步的，所述试剂六中，Na2HP〇4 · 12H20的质量为35.814mg，水的体积为10mL。
[0007] NADP磷酸酶催化NADP水解生成NAD和无机磷，可通过测定NAD或无机磷的变化来间 接反映 NADP磷酸酶活性的高低。
[0008] 一种基于分光光度法的NADP磷酸酶活性测定方法，包括以下步骤： 步骤1仪器和用品的准备； 准备可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、lmL玻璃比色皿、研钵、 冰和蒸馏水； 步骤2样本的前处理； 按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1: (5~10)的比例，进行冰浴匀浆，再采用离心率 8000g，在4°C下，离心10min，取上清，置冰上待测； 步骤3试剂临用前的准备； 1)在每支所述试剂二中加入1 mL所述试剂一，充分溶解备用，现配现用； 2 )在所述试剂三中加入25mL蒸馏水，溶解后备用； 3 )在所述试剂四中加入25mL蒸馏水，溶解后备用； 步骤4 0.5ymol/mL标准磷应用液配制： 将所述试剂六进行20倍稀释，即取0.5mL所述试剂六加入9.5mL蒸馏水，充分混匀； 步骤5定磷试剂的配制； 按水:试剂三:试剂四：试剂五=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色，若无 色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配； 步骤6酶促反应；
1) 在第测定管和对照管中均加入300yL的所述试剂一和100yL的所述试剂二，并均在37 °C (哺乳动物)或25°C (其它物种)下预热5min; 2) 在所述测定管中再加入100此步骤2中前处理过的样本，在所述对照管中再加入100μ L蒸馏水； 3) 将所述测定管在37°C (哺乳动物)或25°C (其它物种)下准确反应30min，接着沸水浴 5min(盖紧，以防止水分散失），冷却后，再采用离心率10000g，常温下离心5min，最后取上清 液； 步骤7定磷；
1) 在标准管中加入lOOyL的0.5ymol/mL标准磷应用液和lOOOyL的定磷试剂，在空白管 中加入l〇〇yL的蒸馏水和lOOOyL的定磷试剂，在测定管中加入100yL步骤6中提取的上清液 和1 OOOyL的定磷试剂，在对照管中加入1 OOyL步骤6中提取的上清液和1 OOOyL的定磷试剂； 2) 将各管内的物质混匀，在37°C(哺乳动物)或25°C(其它物种)下分别水浴30min; 3) 然后将各管冷却至室温，接着将分光光度计的波长调节在660nm处，蒸馏水调零，记 录各管吸光值； 步骤8根据步骤7中得出的各管吸光值，计算NADP磷酸酶活性； 1) 按组织蛋白浓度计算： 定义:每小时每毫克组织蛋白NADP磷酸酶分解NADP产生Ιμπιο?无机磷的量为一个NADP 磷酸酶活力单位； NADP磷酸酶(U/mg prot) = (C雛fX V总）X (Aji賭-細{蹐）+ (Afi繼-Aset) + (V样X Cpr) +Τ= 5 X (Α灘遭-細蹐）+ (Afi繼-Aset) + Cpr; 2) 按样本鲜重计算： 定义:每小时每g组织NADP磷酸酶分解NADP产生Ιμπιο?无机磷的量为一个NADP磷酸酶活 力单位； NADP磷酸酶（U/g鲜重) = (C_1=X V总）X (Α灘證-細赠)+ (Α标體-AsesO X V总+ (WX V样+ 触)+T=5 X (A灘遭-細蹐)+ (Afi繼-Aset) + ff; 其中，A表示步骤7中各管的吸光值； C?隹t=0.5μηιο 1/mL，表示标准管的浓度； V总=0.5mL，表示酶促反应的总体积； V样=0. lmL，表示加入样本的体积； V：tm=lmL，表示加入提取液的体积； T=0.5h，表示反应时间； Cpr表示样本蛋白质的浓度，单位为mg/mL; W表示样本的鲜重，单位为g。
[0009]本发明的有益效果是： 本发明的方法基于分光光度法，并通过钼酸铵定磷法来间接测定NADP磷酸酶活性，相 比孔雀绿定磷法，测定范围更广泛，测定管吸光值和标准管吸光值比对即可计算出NADP磷 酸酶活性，适用于测定不同NADP磷酸酶活性的样品，因此不需要将样品进行稀释。本发明的 试剂盒所用试剂均为常用试剂，成本极低。本发明的试剂盒不仅检测方便，快速，而且可同 时测定多个样本，显色后24小时内，重复性较好。
[0010]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明。本发明的具体实 施方式由以下实施例详细给出。
【具体实施方式】
[0011]下面将结合实施例，来详细说明本发明。
[0012] 实施例1 一种NADP磷酸酶活性测定试剂盒，包括以下试剂： 提取液，1瓶，4°C保存，由5. lg蔗糖、52.6mgEDTA、0.3g牛血清白蛋白和lmg苯甲基磺酰 氟溶于浓度为5〇1111]1〇1/1^!1=7.4，体积为6〇111]^的1'1^8-!1(]1缓冲溶液后配制而成，置于6〇1]11^试 剂瓶中； 试剂一，液体X 1瓶，4°C保存，由0.182gTris溶于少量水后用冰乙酸调节pH=5.5，最后 用水定容至30mL配制而成，置于30mL试剂瓶中； 试剂二，粉剂X 5支，-20 °C保存，均由5.5mgNADP组成，置于lmL离心管中； 试剂三，粉剂X 1瓶，4°C保存，由2.5g抗坏血酸组成，置于25mL试剂瓶中； 试剂四，粉剂X 1瓶，4°C保存，由0.625g钼酸铵组成，置于25mL试剂瓶中； 试剂五，液体X 1瓶，室温保存，由3.47mL浓硫酸与21.53mL水混合而成，置于25mL试剂 瓶中； 试剂六，10mm〇l/L标准磷贮备液X 1瓶，4°C保存，由35.814mgNa2HP〇4 · 12H20溶于10mL 水后配制而成，置于10mL试剂瓶中。
[0013] 一种基于分光光度法且利用上述试剂盒测定NADP磷酸酶活性的方法，包括以下步 骤： 步骤1仪器和用品的准备； 准备可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、lmL玻璃比色皿、研钵、 冰和蒸馏水； 步骤2样本的前处理； 按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1: (5~10)的比例(建议称取约O.lg组织，加入lmL 提取液），进行冰浴匀浆，再采用离心率8000g，在4°C下，离心10min，取上清，置冰上待测； 步骤3试剂临用前的准备； 1)在每支所述试剂二中加入1 mL所述试剂一，充分溶解备用，现配现用； 2 )在所述试剂三中加入25mL蒸馏水，溶解后备用； 3 )在所述试剂四中加入25mL蒸馏水，溶解后备用； 步骤4 0.5ymol/mL标准磷应用液配制： 将所述试剂六进行20倍稀释，即取0.5mL所述试剂六加入9.5mL蒸馏水，充分混匀； 步骤5定磷试剂的配制； 按水:试剂三:试剂四：试剂五=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色，若无 色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配； 步骤6酶促反应；
1) 在测定管和对照管中均加入300yL的所述试剂一和lOOyL的所述试剂二，并均在37°C (哺乳动物)或25°C (其它物种)下预热5min; 2) 在所述测定管中再加入100此步骤2中前处理过的样本，在所述对照管中再加入100μ L蒸馏水； 3) 将所述测定管在37°C (哺乳动物)或25°C (其它物种)下准确反应30min，接着沸水浴 5min(盖紧，以防止水分散失），冷却后，再采用离心率lOOOOg，常温下离心5min，最后取上清 液； 步骤7定磷；
1) 在标准管中加入100yL的0.5ymol/mL标准磷应用液和lOOOyL的定磷试剂，在空白管 中加入l〇〇yL的蒸馏水和lOOOyL的定磷试剂，在测定管中加入100yL步骤6中提取的上清液 和1 OOOyL的定磷试剂，在对照管中加入1 OOyL步骤6中提取的上清液和1 OOOyL的定磷试剂； 2) 将各管内的物质混匀，在37°C(哺乳动物)或25°C(其它物种)下分别水浴30min; 3) 然后将各管冷却至室温，接着将分光光度计的波长调节在660nm处，蒸馏水调零，记 录各管吸光值； 步骤8根据步骤7中得出的各管吸光值，并按组织蛋白浓度，计算NADP磷酸酶活性计 算； 定义:每小时每毫克组织蛋白NADP磷酸酶分解NADP产生Ιμπιο?无机磷的量为一个NADP 磷酸酶