专利名称：半乳糖诊断/测定试剂盒及半乳糖浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种半乳糖诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定半 乳糖浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
技术背景牛奶在营养界素有"液体黄金"的美称，我国早在1992年由七部位联合提出"一杯牛奶强壮一个民族"的口号。奶类除不含纤维素外，几乎含有人体所需要的各种营养素。牛奶中的乳糖进入人体后，经小肠乳糖酶作用 分解成葡萄糖和半乳糖。半乳糖是婴儿大脑发育的必需物质，与婴儿大脑 的迅速成长有密切关系。牛奶虽好但并不是所有的人都能享受，有些人由于乳糖酶的缺乏，人 体不能很好的消化吸收牛奶中的营养素，还会造成钙、磷、钾、铁等元素 的吸收障碍，影响婴幼儿的体格和智力发育，在老年人中，乳糖酶缺乏是 造成骨质疏松的重要原因。中国成年人饮用牛乳后乳糖吸收不良的发病率高达86.7%，不耐受指数为0.9。为了避免不适当饮奶对健康造成的损害，因此最好在饮奶前检查自己 是否耐受乳糖，在饮用牛奶后，'测试尿液中半乳糖的^l度，这是目前国外 最常用的一种方法，更为简便、经济、可靠。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测 定半乳糖浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的半乳糖诊 断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动 生化分析仪上进行半乳糖浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可 以得到切实的推广应用。本发明半乳糖浓度测定方法原理如下半乳糖+氧 半乳糖氧化酶 半乳糖hexodialdose +过氧化氢 过氧化氢+还原型辅酶 NADH过氧化物酶 辅酶+ 2水 这种方法应用半乳糖氧化酶(galactose oxidase;EC l丄3.9)偶联NADH 过氧化物酶(NADHperoxidase; ECl.ll丄l; EC 1.11.1.2)酶促反应连续 监测法/终点比色法。半乳糖氧化酶酶解半乳糖反应产生过氧化氢，再通 过偶联NADH过氧化物酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸 收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅 酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的 程度/速度，可以测算半乳糖的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明半乳糖诊断/测定试 剂盒较为理想缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L半乳糖氧化酶 12000 U/LNADH过氧化物酶 16000 U/L本发明的半乳糖诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、半乳糖氧化酶、NADH过氧化物 酶。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。 试剂2缓冲液、稳定剂、半乳糖氧化酶、NADH过氧化物酶。 还原型辅酶、半乳糖氧化酶、NADH过氧化物酶在试剂1或试剂2中 的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂-试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。 试剂2缓冲液、稳定剂、NADH过氧化物酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、半乳糖氧化酶。还原型辅酶、半乳糖氧化酶、NADH过氧化物酶在试剂1 、试剂2或 试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后 使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定半乳糖浓度的方法，其还原 型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的半乳糖诊断/测定试剂为单试剂，包括-三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L半乳糖氧化酶 12000 U/LNADH过氧化物酶 16000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使 用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸 光度1.8土0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测半乳糖样品 与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大 约0分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出半乳的浓度大小。 实施例二本实施例的半乳糖诊断/测定试剂为双试剂，包括:试剂1(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅f画mmol/L50 mmol/L0.25 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂半乳糖氧化酶 NADH过氧化物酶謂mmol/L 500 mmol/L12000U/L16000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C,反应时间10分钟，起始吸光度1.8士0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测半乳糖样品与试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出半乳糖的浓度大小。实施例三本实施例的半乳求J定试剂为三试剂，包括:试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂还原型辅酶100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂NADH过氧化物酶 试剂3三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂半乳糖氧化酶500 mmol/L16000U/L100 mmol/L 500 mmol/L 12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定半乳糖浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37t，反应时 间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm, 被测半乳糖样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应 方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟 左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出半乳糖 的浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类 同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析 仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的半乳糖浓度测定方法，其方法原理如下半乳糖+氧半乳糖氧化酶半乳糖hexodialdose+过氧化氢过氧化氢+还原型辅酶NADH过氧化物酶辅酶+2水将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出半乳糖的浓度大小测定结果。
2. —种半乳糖诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20-稳定剂 l一—500 mmol/L-4000 mmol/L0.1--0.35 mmol/L1000—1000-■00 U/L-80000 U/L还原型辅酶 半乳糖氧化酶 NADH过氧化物酶其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、半乳糖氧化酶、NADH过氧化物酶 组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、半乳糖氧化酶、NADH过氧化物酶 组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、半乳糖氧化酶、NADH过氧化物酶组成。 还原型辅酶、半乳糖氧化酶、NADH过氧化物酶在试剂1或试剂2中 的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、半乳糖氧化酶、NADH过氧化物酶 组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、NADH过氧化物酶组成；试剂3，由缓冲液、稳 定剂、半乳糖氧化酶组成。还原型辅酶、半乳糖氧化酶、NADH过氧 化物酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括 稳定剂l"^000mmol/L或0.in/。-100n/()体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的半乳糖诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定半乳糖浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、半乳糖氧化酶、NADH过氧化物酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，从而测算出半乳糖的浓度大小。
文档编号C12Q1/26GK101324580SQ20071002338
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司