用于生产重组蛋白质的方法
【专利说明】用于生产重组蛋白质的方法
[0001] 本发明公开涉及用于增加使用DNA序列稳定转染的宿主细胞数量的方法，其中所 述的DNA序列编码目的蛋白质并且能够表达该蛋白质。此外，本发明公开还涉及使用本文 所述的方法制备的宿主细胞以及在该方法中使用的多核苷酸序列，例如RNA或DNA，特别是 质粒DNA。
【背景技术】
[0002] "经培养的哺乳动物细胞已经成为用于生产临床用途的重组蛋白质的主要系统， 由于其具有合适的蛋白质折叠、组装和翻译后修饰的能力。因此，与其他宿主（例如细菌、 植物和酵母菌）相比，当蛋白质在哺乳动物细胞中表达时，蛋白质的品质和效力都可以是 优异的。
[0003] 当今，所有重组蛋白质药物的大约60-70%都是在哺乳动物细胞中生产的。此外， 估计而言目前有几百种临床候选蛋白质在公司的筹备中。这些蛋白质中，许多都是在永生 化的中国仓鼠卵（CH0)细胞中表达的，但是其他的细胞系（例如由小鼠骨髓瘤（NS0)细胞、 幼仑鼠肾（BHK)细胞、人胚肾（HEK-293)细胞和人视网膜细胞衍生的那些）也获得了用于 重组蛋白质生产的管理机构的批准。尽管用于生物药物生产的大部分当今的哺乳动物细胞 培养工艺是基于在悬浮液中培养的细胞，但是人工制造方法的多样性是值得考虑的。
[0004] 最初，将具有必需的转录调节元件的重组基因转移至细胞中。此外，转移可赋予受 体细胞以选择有利性的第二基因。在选择试剂（在基因转移后几天加入）存在下，仅那些表 达选择子基因的细胞存活。用于选择的最普通的基因为二氢叶酸还原酶OHFR)(其为与核 苷酸代谢有关的酶）和谷氨酰胺合成酶（GS)。在这两种情况下，在合适的代谢物（在DHFR 的情况下为次黄嘌呤和胸苷，在GS的情况下为谷氨酰胺）缺失的情况下发生选择，从而阻 止非转化细胞的生长。通常，为了重组蛋白质的有效表达，编码生物药物的基因和选择子基 因是否在相同的质粒上表达是不重要的。
[0005] 在选择后，将存活者以单一细胞的形式转移至第二培养容器中，并且扩增培养物， 从而生产克隆群体。最后，针对重组蛋白质的表达来评价单个克隆，其中最高的生产者被保 留用于进一步的培养和分析。由这些候选物中选择具有合适生长和生产率特征的一个细胞 系用于生产重组蛋白质。然后，建立培养工艺，该工艺由生产需要来确定。至此，所有哺乳 动物重组治疗为天然分泌的蛋白质或者由介导蛋白质分泌的基因构建体研发得到。"
[0006] 上文摘录自2004年出版的Nature综述文章（Florian Wurm Nature Biotechnology Vol 22Number llNovember 2004, page 1393-1398)。在 2012 年，工艺与上 文所述的2004年出版的工艺基本上未发生改变。
[0007] 该Nature Biothechnology综述讨论了随机插入至宿主细胞基因组中的缺点，并 且他们声称事实上在转基因插入至细胞基因组的某些部分（例如被称为异染色质的DNA的 高度螺旋形式）中的情况下，很少或未获得转基因的表达。
[0008] 即使在异源基因插入至基因组的允许区域中，例如被称为常染色质的不紧密包装 的DNA，相邻的基因仍可以发挥不利的影响，并因此可以使基因灭活。
[0009] Nature综述文章中继续宣称：已经研发多种策略来克服随机整合的不利的位置 影响。保护性顺式调节元件包含绝缘子、边界元件、支架/基质附着区域、泛染色质开放元 件和保守的抗阻遏子元件。具有这些元件的侧翼转基因降低异染色质的影响并允许转基因 稳定地表达。用于抑制沉默的另一种方式是使用丁酸酯阻断组蛋白的脱乙酰作用。靶向转 基因整合至基因组的转录活性区域是避免位置影响的另一种可能的策略，并且近年来在讨 论会上的陈述已经暗示了基因靶向在工业中的用途。"
[0010] 在本领域中的一些人员致力于靶向整合，有时称为同源重组，但是这需要良好地 了解宿主细胞的基因组，并且在没有得到酶的进一步帮助下，这些事件相对少见。
[0011] 用于制造目的的合适克隆的生成通常需要大量的筛选和费力的寻找，例如可能需 要分析1500个克隆以识别适用于表达目的蛋白质的一个克隆。
[0012] 本发明人意外地建立了使用编码目的蛋白质和NHEJ蛋白质（例如Ku70、Ku80、其 组合或其功能片段，或者编码它们的序列）的DNA序列共转染宿主细胞得以产生能够表达 目的蛋白质的更多的细胞。
[0013] 发明概述
[0014] 因此，提供了使用NHEJ蛋白质或其功能片段，例如Ku70、Ku80、其组合或者编码它 们的多核苷酸转染的宿主细胞，其中所述的多核苷酸序列处于合适的启动子的控制之下， 并且所述的宿主细胞还被表达盒转染，所述的表达盒包含编码至少一种目的蛋白质的DNA 或RNA序列。
[0015] 在一个实施方案中，提供了使用编码NHEJ蛋白质或其功能片段，例如Ku70、Ku80、 其组合的多核苷酸序列转染的宿主细胞，其中所述的DNA序列处于合适的启动子的控制之 下，并且所述的宿主细胞还被表达盒转染，所述的表达盒包含编码至少一种目的蛋白质的 DNA序列。
[0016] 此外，还通过了包含如下序列的质粒DNA，其中所述的序列编码了 NHEJ蛋白质或 其功能片段，例如Ku70、Ku80、其组合或其功能片段，其中所述的DNA序列处于合适的启动 子的控制之下。
[0017] 本发明公开进一步包含生成如下宿主的方法，所述的宿主能够表达由DNA序列编 码的目的蛋白质，所述的方法包含使用以下物质共转染细胞的步骤：
[0018] a. Ku70、Ku80、其组合或其功能片段，或者编码它们的多核苷
[0019] 酸序列，其中所述的多核苷酸序列处于合适的启动子的控制之下；
[0020] 以及
[0021] b.表达盒，其包含编码目的蛋白质的DNA或RNA序列。
[0022] 在一个实施方案中，提供了生成如下宿主细胞的方法，所述的宿主细胞能够表达 由DNA序列编码的目的蛋白质，所述的方法包含使用以下物质共转染细胞的步骤：
[0023] a?编码NHEJ蛋白质或其功能片段（例如Ku70、Ku80、其组合
[0024] 或其功能片段）的多核苷酸，其中所述的多核苷酸序列处于合适
[0025] 的启动子的控制之下；以及
[0026] b.表达盒，其包含编码目的蛋白质的DNA序列。
[0027] 有利地使用编码NHEJ蛋白质或其功能片段（例如Ku70和/或Ku80)的多核苷酸 似乎增加了所获得的能够表达目的蛋白质的细胞数量。这相应地增加了识别用于表达蛋白 质的、合适且稳定的细胞系的可能性。
[0028] 本发明的方法显著地减少了分离合适的制造用克隆所需的工作量和来源，例如 由于使用所述的方法大幅增加了表达大量蛋白质的克隆的数量，所以可以分析少到25至 75%的克隆。
[0029] 发明详述
[0030] 非同源末端连接（NHEJ)是修复DNA中双链断裂的途径。与需要同源序列来指导 修复的同源重组相比，由于断裂末端无需同源模板而直接连接，所以NHEJ被称为"非同源 的"。
[0031] NHEJ通常利用被称为微同源的短同源DNA序列来指导修复。这些微同源通常存在 于双链断裂末端上的单链突出末端。
[0032] NHEJ在整个生命王国中都是保守的，并且是哺乳动物细胞中的主要的双链修复途 径。但是，在芽殖酵母（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))中，当有机体在普通的试 验室条件下生长时，同源重组占优势。
[0033] NHEJ蛋白质为与NHEJ过程有关或者促进NHEJ过程的蛋白质。
[0034] 在一个实施方案中，NHEJ蛋白质以纯化形式使用。在一个实施方案中，NHEJ蛋白 质包含纯化标签，例如His-标签，从而有助于纯化过程。
[0035] 在本文所用的宿主细胞为在有效转染完成后适用于或者能够表达目的蛋白质的 细胞。当然，表达可能需要合适的功能元件，例如启动子等。
[0036] 在一个实施方案中，宿主细胞为原核生物，例如细菌，例如大肠杆菌（E.coli)。
[0037] 在一个实施方案中，宿主细胞为真核细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞 (例如哺乳动物细胞）。在一个实施方案中，宿主细胞为动物细胞，例如哺乳动物细胞，例如 选自中国仓鼠卵（CH0)细胞，但是可以使用其他的细胞系，例如由小鼠骨髓瘤（NS0)细胞、 幼仑鼠肾（BHK)细胞、人胚肾（HEK-293)细胞和人视网膜细胞衍生的那些可以使用。
[0038] 备选的哺乳动物细胞为绿猴肾脏细胞（vero cell)。
[0039] 非哺乳动物细胞系包含酵母（例如毕赤酵母属）或细菌细胞系（例如大肠杆菌）。
[0040] 如本文所用，转染是指蓄意将核酸或多肽（例如蛋白质）引入细胞中的过程。可 以转染遗传物质，例如超螺旋质粒DNA、线性DNA或siRNA构建体。在一个实施方案中，所述 的术语用于真核细胞中的非病毒方法。
[0041] 动物细胞的转染通常涉及在细胞膜上打开瞬时的孔或"洞"，从而允许物质被吸 收。可以通过如下来实施转染：使用磷酸钙、通过电穿孔或通过将阳离子脂质与所述的物质 混合从而产生脂质体，该脂质体与细胞膜融合并将其负荷存放在里面。
[0042] Ku70为在人类中由XRCC6基因编码的蛋白质。Ku70和Ku80-起构成了Ku异二 聚体，该Ku异二聚体与DNA双链断裂末端结合，并是DNA修复的非同源末端连接（NHEJ)途 径所必需的。此外，还需要其用于V(D)J重组，该重组利用NHEJ途径以促进哺乳动物体液 免疫系统中的抗原多样性。
[0043] 除了在NHEJ中的作用以外，还需要Ku用于端粒长度的保持和亚端粒基因的沉默。 人类蛋白质Ku70具有UniProt编号P12956,鼠蛋白质具有编号P23475。
[0044] 如本文所用，Ku70蛋白质的功能片段是指保持了所述蛋白质的必需生物学功能 (特别是NHEJ功能）的蛋白质片段。
[0045] Ku80为在人类中由XRCC5基因编码的蛋白质。人类蛋白质具有UniProt编号 P13010,鼠蛋白质具有编号P27641。
[0046]如本文所用，Ku80蛋白质的功能片段是指保持了所述蛋白质的必需生物学功能 (特别是NHEJ功能）的蛋白质片段。
[0047] 就多核苷酸而言，功能片段是指编码蛋白质的功能片段的多核苷酸，例如本文所 述的。
[0048] 在一个实施方案中，所用的编码Ku的多核苷酸或蛋白质独立地选自仓鼠、小鼠、 大鼠、人类或