用于防止正亮氨酸错误地掺入蛋白质中的方法和组合物的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2013年3月12日提交的美国临时申请No 61/777,700的权益，以及 2012年9月19日提交的美国临时申请No 61/703, 142的权益，这两个申请都通过引用以其 整体并入本文。
[0003] 序列表
[0004] 本申请包含通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并通过引用以其整体并 入。所述八5(：11副本创建于2013年9月17日，命名为？49671?1_10_序列表41丨，并且大小 45, 847 字节。
技术领域
[0005] 本发明涉及用于防止在细菌中重组蛋白质的生产期间正亮氨酸错误地掺入蛋白 质中的方法和组合物。本发明还提供了用于本文提供的方法和组合物的微生物宿主细胞和 核酸分子。
【背景技术】
[0006] 正亮氨酸，氨基酸甲硫氨酸的类似物，可代替甲硫氨酸残基被错误地掺入蛋白质 中。当在大肠杆菌（Escherichia coli)表达时，许多异源蛋白质在甲硫氨酸残基应出现的 位置被错误地掺入正亮氨酸。正亮氨酸在蛋白质中的错误掺入，特别是在通过重组方法生 产的异源蛋白质中的错误掺入，通常被认为是不希望的，部分原因是产生了具有不希望的 特性的改变的蛋白质。
[0007] 在大肠杆菌中生产重组蛋白质期间，在甲硫氨酸的位置错误地掺入正亮氨 酸已经观察到了 50 多年（见，例如，Munier 和 Cohen(1959)Biochim Biophys Acta 31:378-391 ;Cohen 和 Munier(1956)Biochim Biophys Acta 21:592-593 ;Cohen 和 Munier(1959)Biochim Biophys Acta 31:347-356;和Cowie等人，（1959)Biochim Biophys Acta34:39-46)。例如，在大肠杆菌中重组生产甲硫氨酰牛生长激素（MBS)蛋白质期间，该 蛋白质中约14%甲硫氨酸残基表现出正亮氨酸错误掺入，在天然大肠杆菌蛋白质中约6% 甲硫氨酸残基也被正亮氨酸取代。（参见Bogosian等人，（1989)J Biol Chem 264:531-9)。 在另一实例中，在基本培养基大肠杆菌发酵中生产白细胞介素2导致了在重组蛋白中约 19%的甲硫氨酸残基被正亮氨酸取代（参见18&;[等人，（1988)13;[0011611113;[(^1178 1^8 Commun 156:733-739)。其它的研宄表明，正亮氨酸残基错误地掺入到蛋白质可以发生在 内部的甲硫氨酸残基，还可以发生在氨基末端的甲硫氨酸残基（参见Brown (1973) Biochim Biophys Acta294:527-529;和 Barker 和 Bruton(1979)J Mol Biol 133:217-231)。
[0008] 由于酶甲硫氨酰tRNA合成酶（MetG)的泛化性质，正亮氨酸与甲硫氨酸竞争掺入 蛋白质中（参见 Trupin 等人，（1966)Biochem Biophys Res Commun 24:50-55 ;和 Fersht 和Dingwall (1979)Biochemistryl8:1250-1256)。用大肠杆菌MetG酶的动力学研宄表明， 与正亮氨酸相比，使用甲硫氨酸的MetG酰化约是使用正亮氨酸的4倍高（参见V van Hest 等人，（2000) Am Chem Soc 122:1282-1288)。由于MetG的不严格的底物特异性，正亮氨酸 可以在酰化反应中取代甲硫氨酸，导致正亮氨酸代替甲硫氨酸错误地掺入蛋白质中。
[0009] 在重组蛋白生产中正亮氨酸残基取代甲硫氨酸残基的错误掺入通常被认为是不 希望的。含有错误地掺入的正亮氨酸残基的重组蛋白或多肽可表现出改变的结构和功能特 征，诸如，例如，改变的对蛋白水解的灵敏度，减少的生物活性，或增加的免疫原性。
[0010] 已经开发了各种减少或防止重组蛋白质生产期间正亮氨酸错误地掺入的策略。例 如，已通过在发酵过程中补充具有甲硫氨酸的细胞培养基（通过连续或浓注进料（bolus feed)/添加甲硫氨酸）确保细胞可获得过量甲硫氨酸，从而减少了甲硫氨酰tRNA不正确的 加载正亮氨酸的概率（见，例如，美国专利号5, 599, 690)。虽然连续或浓注进料/添加甲硫 氨酸降低了重组蛋白质中错误地掺入正亮氨酸的程度，但是其可能增加发酵过程的操作复 杂性和成本。另外，发酵过程中连续或浓注进料/添加甲硫氨酸可导致不希望的发酵罐中 内容物的稀释，导致较低的细胞密度和较低的产品产量。
[0011] 已经通过删除参与正亮氨酸生物合成途径的基因，例如，删除亮氨酸操纵子 (leuA，leuB，LeuC和IeuD)的基因或删除转氨酶编码基因如ilvE或tyrB，来减少正亮氨 酸错误地掺入蛋白质中（参见Bogosian等人，（1989)J Biol Chem 264:531-539;Tsai 等人，（1989)Biochem Biophys Res Commun 156:733-739 ;和 Randhawa 等人，（1994) Biochemistry 33:4352-4362)。然而，为了防止正亮氨酸错误掺入的生物合成途径的基因 的删除，可能需要在发酵过程中向培养基中添加其它氨基酸（如亮氨酸或异亮氨酸），因 为涉及正亮氨酸生物合成的许多基因也参与支链氨基酸的生物合成（参见Bogosian等 人，（1989) J Biol Chem 264:531-539;见本说明书的图 8)。
[0012] 用于防止正亮氨酸错误掺入的另一策略包括降解正亮氨酸的酶的共表达，包括， 例如，氨基酸脱氢酶和氨基酸氧化酶。然而，这种方法需要这些酶的过表达，这在重组蛋白 的生产过程中可能是不希望的，并可能导致较低的重组蛋白产量（见，例如，美国专利申请[0013] 如以上所指出的，目前使用的在微生物中生产重组蛋白期间防止正亮氨酸错误掺 入的方法伴有各种缺点；因此，需要一种新的方法，其用于防止或减少正亮氨酸错误掺入到 蛋白质，特别是在微生物（如大肠杆菌）中的重组蛋白质生产期间。
[0014] 本发明通过提供有效防止在微生物中生产重组蛋白质期间的正亮氨酸错误掺入 的工程化的微生物宿主细胞满足了这一需要，例如，细菌。除其他外，本发明提供包含突变 的metA和metK等位基因（即，改变的metA和metK核酸序列）的大肠杆菌宿主细胞，其导 致由该微生物生产的甲硫氨酸至足以减少或防止正亮氨酸错误掺入蛋白质中和多肽的程 度或范围。利用这样的宿主细胞产生的重组蛋白质的分析表明，消除了代替甲硫氨酸残基 的正亮氨酸残基的错误掺入。本发明还表明，使用这样的大肠杆菌宿主细胞的发酵工艺性 能，包括宿主细胞的生长，利用这样的大肠杆菌宿主细胞的重组蛋白质产物滴度，比得上对 照宿主细胞中所观察到的。
【发明内容】
[0015] 本发明的一部分提供了用于预防或减少正亮氨酸错误地掺入到蛋白质中和多肽 中的方法和组合物。本发明的方法和组合物可用于预防或减少正亮氨酸错误地掺入由微生 物表达的异源（例如重组）蛋白质和多肽中，所述微生物如细菌（例如，大肠杆菌）。
[0016] 在一些实施方案中，本发明提供了用于预防或减少正亮氨酸错误地掺入到由微生 物表达的蛋白质或多肽中的方法，其中微生物产生足以防止或减少正亮氨酸错误地掺入到 蛋白质或多肽的程度或范围的甲硫氨酸。在一些实施方案中，微生物是反馈抗性或反馈不 敏感的高丝氨酸琥珀酰转移酶微生物。在其它实施方案中，微生物是包含突变的metA等位 基因、突变的metK等位基因或突变的metA等位基因和突变的metK等位基因的微生物。
[0017] 在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中 或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变 的metA等位基因，其中所述突变的metA等位基因包含编码MetA中氨基酸取代的核酸序 列，所述MetA氨基酸取代选自在氨基酸位置27的精氨酸至半胱氨酸的取代、在氨基酸位置 64的谷氨酰胺至谷氨酸的取代、在氨基酸位置294的酪氨酸至半胱氨酸的取代、在氨基酸 位置296的异亮氨酸至丝氨酸的取代和在氨基酸位置298的脯氨酸至亮氨酸的取代。在一 些实施方案中，突变的metA等位基因包含编码MetA中氨基酸取代的核酸序列，所述MetA 中的氨基酸取代包括在氨基酸位置296的异亮氨酸至丝氨酸的取代和在氨基酸位置298的 脯氨酸至亮氨酸的取代。在本文说明书中描述的MetA氨基酸位置参照示于图7A和SEQ ID NO :29的野生型MetA氨基酸序列。
[0018] 在其他实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中 或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变 的metA等位基因，其中所述突变的metA等位基因包括选自SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、 SEQ ID NO :25 和 SEQ ID NO :26 的核酸序列。
[0019] 如上所述，本发明提供了用于防止或减少正亮氨酸错误掺入到由微生物表达的蛋 白质中或多肽中的方法，其中微生物产生足以防止或减少正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或 多肽中的程度或范围的甲硫氨酸。在其他实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮 氨酸错误掺入到由微生物表达的蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达 蛋白质或多肽，其中所述微生物是解除甲硫氨酸生产抑制的微生物。在一些实施方案中， 微生物是由于部分损失S-腺苷甲硫氨酸合成酶功能而解除甲硫氨酸生产抑制。在其他实 施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到由微生物表达的蛋白质中或 多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变的 metK等位基因。在一些实施方案中，突变的metK等位基因导致部分损失MetK功能。
[0020] 在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中 或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变 的metK等位基因，其中所述突变的metK等位基因包含编码MetK中氨基酸取代的核酸序 列，所述MetK中氨基酸取代包括在氨基酸位置185的缬氨酸至谷氨酸的取代。在其他实施 方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所 述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变的metK等位基因，其 中所述突变的metK等位基因包含在metK等位基因的核酸残基位置1132上包含胞嘧啶碱 基缺失的核酸序列。在本说明书中描述的MetK氨基酸位置参照示于图8A和SEQ ID NO :30 中的野生型MetK氨基酸序列。在本说明书中描述的metK核酸位置参照如图8B和SEQ ID NO :32所示的野生型metK核酸序列。
[0021] 在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中 或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变 的metK等位基因，其中所述突变的metK等位基因包括选自SEQ ID NO :27和SEQ ID NO: 28的核酸序列。
[0022] 在其他实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中 或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变 的metA等位基因和metK等位基因。在一些实施方案中，突变的metA等位基因包含编码在 MetA氨基酸位置294的酪氨酸至半胱氨酸取代的核酸序列，以及所述突变的metK等位基因 包含编码在MetK氨基酸位置185的缬氨酸至谷氨酸取代的核酸序列。在其他实施方案中， 本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包 括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变的metA等位基因和metK等位 基因，其中突变的metA等位基因包含编码在MetA氨基酸位置294的酪氨酸至半胱氨酸取 代的核酸序列，以及其中所述突变的metK等位基因包含在metK等位基因的核酸残基位置 1132上包含胞嘧啶碱基缺失的核酸序列。
[0023] 在其他实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中 或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变 的metA等位基因和突变的metK等位基因，并且其中所述突变的metA等位基因包含SEQ ID NO :24的核酸序列，和突变的metK等位基因包含SEQ ID NO :27的核酸序列。在其他实施 方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所 述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变的metA等位基因和 突变的metK等位基因，其中所述突变的metA等位基因包含SEQ ID NO :24的核酸序列，以 及突变的metK等位基因包含SEQ ID NO :28的核酸序列。
[0024] 本发明还提供了对于防止或减少正亮氨酸错误地掺入到由微生物宿主细胞表达 的蛋白质和多肽是有用的微生物宿主细胞。本发明还提供了用于由微生物宿主细胞表达蛋 白质或多肽的微生物宿主细胞，其中所述表达的蛋白质中或多肽中不含正亮氨酸的错误掺 入。在一些实施方案中，微生物宿主细胞是细菌。在其它实施方案中，微生物宿主细胞是大 肠杆菌。
[0025] 本发明提供了微生物（例如，微生物宿主细胞），其中该微生物产生足以防止或减 少正亮氨酸错误掺入到由微生物表达的蛋白质中或多肽中的程度或范围的甲硫氨酸。在一 些实施方案中，本发明提供了微生物，其中所述微生物是反馈不敏感的高丝氨酸琥珀酰转 移酶微生物。在其他实施方案中，本发明提供了包含突变的metA等位基因的微生物。在一 些实施方案中，本发明提供了包含突变的metA等位基因的微生物