使用硫酯酶变异体的脂质的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种硫酯酶变异体以及使用了其的脂质的制造方法。
【背景技术】
[0002] 脂肪酸为脂质的主要构成成分的一种，在生物体内脂肪酸与甘油进行酯结合构成 二酰基甘油等脂质，在大多数动植物中为作为能量源进行存储利用的物质。积蓄在动植物 内的脂肪酸或脂质作为食用或工业用而被广泛地利用，例如，利用为单酰基甘油、二酰基甘 油等食品的中间原料或其它各种工业产品的添加剂、中间原料。另外，将碳原子数为12~ 18左右的高级脂肪酸还原而得到的高级醇的衍生物可以用作表面活性剂。例如，烷基硫酸 酯盐或烷基苯磺酸盐等可以利用为阴离子型表面活性剂，另外，聚氧化烯烷基醚或烷基聚 糖苷等可以利用为非离子型表面活性剂，这些都可以作为清洁剂或杀菌剂进行利用。同样 地作为高级醇的衍生物的烷基胺盐或者单或二烷基季胺盐可以作为纤维处理剂或毛发护 理剂或杀菌剂进行利用，苯扎型季铵盐日常可以作为杀菌剂或防腐剂进行利用。进一步，碳 原子数为18左右的高级醇作为植物的成长促进剂也有用。
[0003] 这样脂肪酸酯类的利用涉及许多方面，因此，尝试进行动植物等中提高生物体内 的脂肪酸或脂质的生产性。例如，提出有通过乙酰基CoA脱羧酶（ACCase)的导入来提高种 子中的脂质量的方法（专利文献1、非专利文献1、专利文献5);通过酵母sn-2酰基转移酶 (SLCl-I)的导入来提高种子中的脂质量的方法（专利文献2、专利文献3和非专利文献2); 通过二酰基甘油酰基转移酶（DGAT)基因的导入来提高种子中的脂质量的方法（专利文献4 和非专利文献3)等。另外，作为与脂肪酸的生物合成相关的酶，已知有来自油椰子(Elaeis guineensis)的酰基-ACP硫醋酶（专利文献6)、来自椰子(Cocos nucifera L )的酰 基-ACP硫醋酶（专利文献7)、改变了一部分来自加州月桂树(Umbellularia californica) 的酰基-ACP硫酯酶的氨基酸序列的硫酯酶（专利文献8)等。
[0004] 现有技术文献
[0005] 专利文献
[0006] 专利文献1 :日本特开2002-335786号公报
[0007] 专利文献2 :日本特表平11-506323号公报
[0008] 专利文献3 :国际公开第2008/076377号小册子
[0009] 专利文献4 :国际公开第2000/036114号小册子
[0010] 专利文献5 :美国专利第5, 925, 805号说明书
[0011] 专利文献6 :日本特开平8-205863号公报
[0012] 专利文献7 :日本特开2011-250781号公报
[0013] 专利文献8 :日本特开2011-147438号公报
[0014] 非专利文献
[0015] 非专利文献 I :Madoka Y, Tomizawa K, Mizoi J, Nishida I, Nagano Y, Sasaki Y. , aChloroplast transformation with modified accD operon increases acetyl-CoA carboxylase and causes extension of leaf longevity and increase in seed yield in tobacco"，Plant Cell Physiol.，2002Dec，43(12)，p. 1518-1525
[0016] 非专利文献 2 :Zou J，Katavic V，Giblin EM，Barton DL，MacKenzie SL，Keller WAj Hu X，Taylor DC. , "Modification of seed oil content and acyl composition in the brassicaceae by expression of a yeast sn-2acyItransferase gene"，Plant Cell，1997Jun，9 (6)，p. 909-923
[0017] 非专利文献 3 :Jako C，Kumar A，Wei Y，Zou J，Barton DL，Giblin EM，Covello PS，Taylor DC.，uSeed-specific over-expression of an Arabidopsis cDNA encoding a diacylglycerol acyl transferase enhances seed oil content and seed weight''，Plant Physiol.，2001，126 (2)，p. 861-874
【发明内容】
[0018] 本发明的课题在于提供一种改变了野生型硫酯酶的氨基酸序列的硫酯酶变异体、 以及使用了其的脂质的制造方法。另外，本发明的课题在于提供导入硫酯酶变异体提高了 脂质生产能力的转化子。
[0019] 本发明者们为了提高动植物等的脂质生成能力，进行了专心研究。其结果发现：将 来自椰子（Cocos nucifera)的硫醋酶的氨基酸序列进行了一部分改变，导入了该硫醋酶变 异体的转化子与导入了野生型的硫酯酶的转化子相比较，显著地提高了脂质的生产性。本 发明是基于该发现从而完成的。
[0020] 即，本发明涉及一种脂质的制造方法（以下也称为"本发明的制造方法"），其包 括：在宿主中导入编码下述（a)或（b)的蛋白质的基因从而得到转化子的工序；和从得到 的转化子中采取脂质的工序，
[0021] (a)具有序列号1的第112号至第414号的氨基酸序列、且相当于序列号1的第 209号的氨基酸由色氨酸置换为苏氨酸、谷氨酸或者丙氨酸的氨基酸序列，并且具有硫酯酶 活性的蛋白质；
[0022] (b)具有在（a)的蛋白质的氨基酸序列中相当于序列号1的第209号的氨基酸以 外的1个或多个氨基酸缺失、置换、插入或者附加后的氨基酸序列，并且具有硫酯酶活性的 蛋白质。
[0023] 另外，本发明涉及一种提高脂质的生产性的方法，其包括在宿主中导入编码所述 (a)或（b)的蛋白质的基因，从而得到转化子的工序。
[0024] 另外，本发明涉及一种转化子（以下，也称为"本发明的转化子"），其为在宿主中 导入编码所述（a)或（b)的蛋白质的基因而得到的。
[0025] 进一步，本发明涉及所述（a)或（b)的蛋白质（以下也称为"本发明的硫酯酶变异 体"）。
[0026] 本发明的转化子与导入了野生型硫酯酶的转化子相比具有优异的脂质生产能力。 因此，使用了该转化子的本发明的制造方法的脂质生产性优异。本发明的硫酯酶变异体、转 化子以及制造方法可以优选用于脂肪酸和脂质的工业生产。
[0027] 本发明的上述以及其它特征和优点可以由下述的记载进一步明确。
【具体实施方式】
[0028] 以下，对本发明的硫酯酶变异体、使用了其的转化子以及脂质的制造方法依次进 行说明。
[0029] 在本发明中，脂质包含中性脂肪、蜡、神经酰胺等单纯脂质、磷脂、糖脂、硫脂等复 合脂质、脂肪酸、醇类、烃类等衍生脂质。
[0030] 1.硫酯酶变异体
[0031] 本发明的硫醋酶变异体是具有将来自序列号1所示的椰子（Cocos nucifera)的 野生型硫酯酶（以下也简称为野生型硫酯酶，简写为CTE)的氨基酸序列部分改变的氨基酸 序列，并且具有硫酯酶活性的蛋白质。
[0032] 硫酯酶是将作为与三甘油酯的生成合成体系相关的酶的酰基-酰基载体蛋白 质（Acyl-ACP)硫酯酶的、在叶绿体内或色素体内作为脂肪酸生物合成过程的中间体的酰 基-酰基载体蛋白质（由作为脂肪酸残基的酰基和酰基载体蛋白质构成的复合体）的硫酯 键水解，生成游离的脂肪酸的酶。通过硫酯酶的作用，酰基载体蛋白质上的脂肪酸合成结 束，游离的脂肪酸由色素体输送并供给三甘油酯合成。可知硫酯酶根据构成作为基质的酰 基-酰基载体蛋白质的脂肪酸残基的种类显示不同的反应特异性，认为是决定生物体内的 脂肪酸组成的重要的因素。
[0033] 作为本发明的硫酯酶变异体，具体来说，可以列举下述（a)或（b)的蛋白质。
[0034] (a)具有序列号1的第112号至第414号的氨基酸序列、且相当于序列号1的第 209号的氨基酸由色氨酸置换为苏氨酸、谷氨酸或者丙氨酸的氨基酸序列，并且具有硫酯酶 活性的蛋白质；
[0035] (b)具有在（a)的蛋白质的氨基酸序列中相当于序列号1的第209号的氨基酸以 外的1个或多个氨基酸缺失、置换、插入或者附加后的氨基酸序列，并且具有硫酯酶活性的 蛋白质。
[0036] 所述（a)的蛋白质至少具有序列号1所示的野生型硫酯酶的氨基酸序列的第112 号至第414号的氨基酸序列。在序列号1所示的野生型硫酯酶的氨基酸序列中，第112号 至第415号的区域是用于起到作为硫酯酶的作用的特别重要的，用于显示硫酯酶活性的 充分必要的区域（参照 Voelker, T. A.，A. C. Worrell, L. Anderson, J. Bleibaum, C. Fan, D. H. Hawkins, S. Ε. Radke, and Η. Μ. Davies, "Fatty acid biosynthesis redirected to medium chains in transgenic oilseed plants", Science, 1992, 257, p. 72-74) 〇 所述（a) 的蛋白质对于该硫酯酶活性来说具有充分必要的区域，如后述的实施例中所证实的，起到 作为硫酯酶的作用。
[0037] 进一步，所述（a)的蛋白质的氨基酸序列中，序列号1的第112号至第414号的氨 基酸序列中的相当于序列号1的第209号的色氨酸（Trp，W)被选自苏氨酸（Thr，T)、谷氨 酸（Glu，E)以及丙氨酸（Ala，A)中的任一的氨基酸置换。
[0038] 以下，将相当于序列号1的第209号的氨基酸被置换为苏氨酸的硫酯酶变异体简 写为CTE(W209T)，将相当于序列号1的第209号的氨基酸被置换为谷氨酸的硫酯酶变异体 简写为CTE(W209E)，将相当于序列号1的第209号的氨基酸被置换为丙氨酸的硫酯酶变异 体简写为CTE(W209A)。
[0039] 所述（b)的蛋白质为具有在所述（a)的蛋白质的氨基酸序列的一部分中具有缺 失、置换、插入或附加后的变异的氨基酸序列，并且具有硫酯酶活性的蛋白质。但是，具有缺 失、置换、插入或附加后的变异的是所述（a)中相当于进行了置换的序列号1的第209