专利名称：：一种检测土壤中芳基硫酸酯酶活性的分析方法
技术领域：
：本发明涉及土壤中芳基硫酸酯酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤中芳基硫酸酯酶活性的分析方法。
背景技术：
：土壤中的芳基硫酸酯酶能将在土壤硫代谢过程中形成的有机硫酸酯酯水解成硫酸盐，参与有机硫的释硫过程，成为可被微生物和作物利用的有效态。在pH4—9的土壤中均有芳基硫酸酯酶，多以积累态存在。芳基硫酸酯酶可水解对硝基苯磷酸盐，通过比色法测定反应后释放的对硝基苯酚的含量，来估算芳基硫酸酯酶的活性。R-P-S03-+H20芳基硫酸酯酉lR—OH+H++SO,土壤中芳基硫酸酯酶活性的强弱影响到土壤硫代谢过程中硫素营养的大小，间接影响硫肥的利用效率。土壤芳基硫酸酯酶对土壤硫素的有效性具有重要作用，可以表征土壤有机硫酸酯的转化方向和强度。土壤中芳基硫酸酯酶的活性受土壤条件如水分、温度、土壤质地等的强烈影响，同时也受农田耕作制度、管理措施以及不同作物的影响。因此，对土壤中芳基硫酸酯酶活性的检验具有重要的意义。目前有关芳基硫酸酯酶活性的测定虽然已经形成一个相对可靠的方法，但仍然具有一定的缺陷，造成不同土壤类型测定的差异性，以及不同培养批次的差异性和不确定性，难以定性比较和定量研究土壤中芳基硫酸酯酶活性，降低了实验效率。
发明内容本发明的目的在于提供一种土壤中芳基硫酸酯酶活性的检测方法。在借鉴其它酶测定方法原理的基础上，本发明方法根据芳基硫酸酯酶的特性，对其测定歩骤和显色方法进行改进。该方法减少了试验步骤的不稳定性，使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种检测土壤中芳基硫酸酯酶活性的分析方法，1)分别称取lg-2g鲜土样品2n份分别置于2n个三角瓶中，论3，一分成二组，每组n个，向2n个三角瓶中加入4-8mLpH=5.75-5.85乙酸缓冲溶液，向第一组n个三角瓶中加入1-2mL25-50mmoL.L"的底物对硝基苯硫酸钾工作液，第二组n个三角瓶作底物试剂对照，混匀，盖好瓶塞，放在36.5"C-37.5。C恒温培养中恒温培养1-2h;2)培养结束后，加入4-8mL0.49-0.51moL.L-'碱性三THAM(羟基氨基甲烷)溶液和1-2mL0.49-0.51moL.L"氯化钙溶液，并向第二组三角瓶中加入1-2mL25-50mmoLL"的底物对硝基苯硫酸钾工作液，混匀，过滤；所述的碱性THAM溶液是用来终止酶促反应并加以显色，抑制对硝基苯硫酸酯到对硝基苯酚和硫酸根的反应，且不会产生强碱对土壤有机质的分解作用而对产物测定产生颜色干扰，同时避免测定过程中产生碳酸钙沉、)*而具；M向、)则*i刍壬n〉你7T伤，A1_IIIJ'JiX"|%|i;/、'J/4_UJ'l;。、A(^。HIpnH乂IJo3)用分光光度法于410nm处分别测定上述所得三角瓶中溶液的吸光度A;以对硝基苯酚溶液标准溶液，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和其分别用分光光度法在410nm测定的吸光值A，制作工作标准曲线，得到斜率b;根据吸光值A和斜率b，计算所测定滤液中对硝基苯酚的浓度S，S=A*b;计算样品中对硝基苯酚含量mn4)计算磷酸单酯酶酶活性计算公式为:w二m"(m2xK)=S吗C6H5N03.g-1干土.h"式中W:单位土壤单位时间内对硝基苯船的产生量；m1:测试溶液中对硝基苯酚的质量，样品测定吸光值折换的产物质量值；m2:鲜土样品质量；k:水分系数，烘干土的重量/鲜土重。用分光光度计于410nm处测定吸光度A时，先观察待测液颜色，当步骤3)中所述的待测液颜色明显超过制作标准曲线最高浓度时的颜色，表明其中对硝基苯酚含量过高，则用原缓冲溶液稀释5-10倍后再进行比色，若颜色还是过深，则重复上述稀释过程；最终再用分光光度法于410nm处测定溶液的吸光度A。所述制作工作标准曲线过程为，称取IOOOmg对硝基苯酚溶解于lL蒸馏水中，制备1mgmL—1标准贮备液；吸取标准贮备液1mL，定容到100mL，此为0.01mg.mL"对硝基苯酚的溶液；再分别吸取该液0、1、2、3、4、5mL于试管中，用蒸馏水分别补足到相同体积5mL，加入4mL0.1moL'L"碱性三羟基氨基甲烷溶液和lmL0.5moL.L"氯化钙溶液，显色、混匀，过滤到比色试管中，与样品一起在410nm测定吸光度A，；此标准系列含对硝基苯酚的浓度分别为0、1、2，3、4禾Q5|ig'mL"(量为0，10，20，30、40和50吗)。以对硝基苯酚溶液的系列浓度和测定的吸光值A'制作工作标准曲线，得到斜率b。本发明方法改进的依据土壤中的芳基硫酸酯酶是参与土壤中有机硫酸酯脱硫到生成硫酸根过程的一切酶的总称，在测定过程中分解底物对硝基苯硫酸钾生成对硝基苯酚，需要加入氢氧化钠和氯化钙终止反应并显色。一定浓度的氢氧化钠加入土壤溶液中会造成土壤有机质分解，生成产物呈褐色，在一定程度上影响比色结果。本试验中添加碱性三羟基氨基甲垸溶液即可避免土壤有机质分解，减少颜色干扰；同时避免碳酸钙沉淀的生成影响测定的准确与稳定。本发明所使用的测定原理为土壤中的芳基硫酸酯酶与对硝基苯硫酸酯反应，释放对硝基苯酚，通过测定单位时间内生成产物的含量，来估计土壤芳基硫酸酯酶的活性。因此，本试验拟通过反应后对硝基苯酚C6H5N03的生成量来表征土壤芳基硫酸酯酶活性。与其它酶的分析方法相比较，本发明的优点主要有1)所需设备简单、降低了试验成本。本发明中的培养试验是在50mL的三角瓶中进行。2)所使用的方法显色简单，提高了样品测定的准确度。3)操作简单，减少操作过程的复杂性；分析结果稳定可靠，重现性好。该酶的其它测定方法中需要设置灭菌土壤作为对照，本方法只需要不加底物的样品对照。同时，由于本发明所涉及到的显色步骤减少了土壤有机质碱解形成的颜色对测定结果的影响而导致不确定性，故分析结果重现性非常良好。具体实施例方式试剂配制1)对硝基苯硫酸钾溶液(0.05mol'L—1):称取0.9303g六水对硝基苯硫酸钾两份分别溶于40mL乙酸缓冲溶液，然后用同一种缓冲溶液稀释至50mL，低温!亡存备用。2)乙酸缓冲溶液(pH5.8):称取68g三水乙酸钠溶于700mL水中，然后加入1.70mL的冰乙酸(99%)，用水稀释到1L，备用。3)0.5molL—"CaCl2溶液称取73.5gCaCl2.2H20溶解于700mL水中，用水定容到1L。4)THAM碱性溶液(0.1mol丄人pH12):溶解12.2g三羟甲基氨基甲烷(THAM)于800mL蒸馏水中，用0.5molL—1的NaOH调节pH至12.0，用蒸馏水定容到lOOOmL。5)对硝基苯酚标准溶液溶解1.000g对硝基苯酚于700mL水中，稀释至1L，放于4^冰箱低温保存，保存时间不宜过长，以不超过数周为操作步骤1)分别称取1.2g鲜土样品12份分别置入12个50mL三角瓶中，向12个三角瓶中加入4ml缓冲溶液作试剂，向第一组6个三角瓶中加入1mL50mmoL.I/1的底物对硝基苯硫酸钾工作液，第二组6个三角瓶作底物试剂对照，混匀，盖好瓶塞，放在37'C恒温培养中恒温培养lh;2)培养结束后，加入4mL0.1moL'L"碱性THAM(三羟基氨基甲烷)溶液和1mL0.5moL.L"氯化钙溶液，并向对照组三角瓶中加入1mL50mmoL，L—'的底物对硝基苯硫酸钾工作液，混匀，过滤；3)用分光光度法于410nm处测定吸光度A，如待测液颜色明显超过标准曲线最高浓度颜色，表明其中对硝基苯酚含量过高，则用原缓冲液稀释5倍后再进行比色；4)制作工作标准曲线称取1000mg对硝基苯酚溶解于1L蒸馏水中，制备标准贮备液。吸取标准贮备液1mL，定容到100mL，此为0.01mgmL—1对硝基苯酚的溶液。再分别吸取该液0、1、2、3、4、5mL于试管中，用^fer々切-D丄口sn士H&1乂士$门c,t+n"X/it;;eI"W^::y:乂—Nit:每lit:m丄々、、,*、、,*■/ac沾々H5/J、一[TAC;t'J'rHIWK十、1SJlllL，乂JH/、4，凡l工_^一工巫突、巫「厂WUtH"Y'DC、wjmoL-L")禾卩l-5mL氯化转(0.5moL-I/1)溶液，显色、混匀，过滤到比色试管中，与样品一起在410nm处测定吸光度A'。此标准系列含对硝基苯酚的量分别为0、1、2，3、4和5昭.mL"(量为0，10，20，30、40和50吗)，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和测定的吸光值A'制作工作标准曲线，得到斜率b。5)根据吸光值A和斜率b，计算所测定滤液中对硝基苯酚的浓度S(S=A*b);计算样品中对硝基苯酚含量m,;计算芳基硫酸酯酶酶活性计算公式为w二m"(m2xK)=吗C6H5N03'g—'干土'h"实施例1木实施例所使用的黑土采自中国科学院海伦生态试验站，设三个不同的处理l号为对照，即不经过任何添加剂的处理的土壤在25"C培养48h以上的普通土壤；2号为添加土壤调理剂还原型谷胱甘肽且在25'C培养48h以上的土壤；3号为添加土壤调理剂腐殖酸且在25t:培养48h以上的土壤。土壤含水量均为20%(烘干土重)。2号和3号土壤中，调理剂的添加量是土壤重量的0.4%，用上述方法检测三种处理的芳基硫酸酯酶活性。每种土壤的具体分析歩骤如下1)分别称取1.2g鲜土样品12份分别置入12个50mL三角瓶，向二组6个三角瓶中加入缓冲溶液，向第一组6个三角瓶中加入1mL50mmoL'L—'的底物对硝基苯硫酸钾工作液，第二组6个三角瓶作底物试剂对照，混匀，盖好瓶塞，放在37'C恒温培养中恒温培养lh;2)培养结束后，向所有三角瓶中加入4mL0.1moL'L-1碱性三羟基氨基甲烷溶液和1mL0.5moL.L"氯化钙溶液，并向第二组三角瓶中加入1mL50mmoL'L"的底物对硝基苯硫酸钾工作液，混匀，过滤；3)用分光光度法于410nm处测定吸光度A，如待测液中对硝基苯酚含量过高，则用原缓冲液稀释后再进行比色；4)制作工作标准曲线称取1000mg对硝基苯酚溶解于蒸馏水中，制备标准贮备液。吸取标准贮备液1mL，定容到100mL，此为0.01mgmL—1对硝基苯酚的溶液。再分别吸取该液O、1、2、3、4、5mL于试管中，用蒸馏水补足到相同体积5mL，加入4mL碱性三羟基氨基甲烷溶液(0.1moL.L")禾n1mL氯化转(0.5moL.L-')溶液，显色，混匀，过滤到比色试管中，与样品一起在410nm处测定吸光度A'。此标准系列含对硝基苯酚的量分别为0、1、2，3、4禾卩5pg'm!/1(量为0，10，20，30、40和50|ig)，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和测定的吸光值A，制作工作标准曲线，得到斜率b。5)根据吸光值A和斜率b，计算所测定滤液中对硝基苯酚的浓度S(S=A*b);计算样品中对硝基苯酚含量m1;r^丄L/^rsfiti3Sfe、、,=C,kUu乂w^r-夕7巫别L股曰日日g:日g^tvi:土试验结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表中数据可以看出，各处理之间结果差异达到显著水平，较小的标准差值表明该分析方法结果之间的偏差较小，精确度较高，重现性好。且待测定液体放置l一3小时没有沉淀产生，保证了测定的稳定性。实施例2本实施例所使用的三种不同种植作物的潮棕壤均采自中国科学院沈阳生态实验站其中4号土壤前茬作物为水稻，5号土壤前茬作物为玉米，6号土壤前茬作物为大豆。三种不同耕作制度的土壤均在含水量为20%(烘干土重)，在温度25。C条件下培养24h以上，测定其芳基硫酸酯酶活性，具体步骤同实例1。试验结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表屮数据同样显示了分析结果的稳定性及较高的精密度。且待测定液体放置l一3小吋没有沉淀产生，保证了测定的稳定性。木发明优点为l)简化了操作歩骤，减少了实验过程中的不确定性；2)减少对设备要求的依赖性；3)方法准确度高，易操作；4)结果稳定可靠，重现性好。权利要求1.一种检测土壤中芳基硫酸酯酶活性的分析方法，其特征在于1)分别称取1g-2g鲜土样品2n份分别置于2n个三角瓶中，n≥3，分成二组，每组n个，向2n个三角瓶中加入4-8mLpH＝5.75-5.85乙酸缓冲溶液，向第一组n个三角瓶中加入1-2mL25-50mmoL·L-1的底物对硝基苯硫酸钾工作液，第二组n个三角瓶作底物试剂对照，混匀，盖好瓶塞，放在36.5-37.5℃恒温培养中恒温培养1-2h；2)培养结束后，加入4-8mL0.49-0.51moL·L-1碱性THAM(三羟基氨基甲烷)溶液和1-2mL0.49-0.51moL·L-1氯化钙溶液，并向第二组三角瓶中加入1-2mL25-50mmoL·L-1的底物对硝基苯硫酸钾工作液，混匀，过滤；3)用分光光度法于410nm处分别测定上述所得三角瓶中溶液的吸光度A；以对硝基苯酚溶液标准溶液，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和其分别用分光光度法在410nm测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b；根据吸光值A和斜率b，计算所测定滤液中对硝基苯酚的浓度S，S＝A*b；计算样品中对硝基苯酚含量m1；4)计算磷酸单酯酶酶活性计算公式为w＝m1/(m2×K)＝SμgC6H5NO3·g-1干土·h-1式中w单位土壤单位时间内对硝基苯酚的产生量；m1测试溶液中对硝基苯酚的质量，样品测定吸光值折换的产物质量值；m2鲜土样品质量；k水分系数，单位重量的烘干土重/鲜土重。2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于用分光光度计于410nm处测定吸光度A时，先观察待测液颜色，当步骤3)中所述的待测液颜色明显超过制作标准曲线最高浓度时的颜色，表明其中对硝基苯酚含量过高，则用原缓冲溶液稀释5-10倍后进行比色；若稀释后颜色还是过深，则重复上述稀释过程；最终再用分光光度法于410nm处测定溶液的吸光度A。3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述制作工作标准曲线过程为，称取1000mg对硝基苯酚溶解于1L蒸馏水中，制备1mgmL—1标准贮备液；吸取标准贮备液1mL，定容到100mL，此为0.01mg.mL—'对硝基苯酚的溶液；再分别吸取该液0、1、2、3、4、5mL于试管中，用蒸馏水分别补足到相同体积5mL，加入4mL0.1moL.L"碱性THAM(三羟基氨基甲垸)溶液和lmL0.5moL'L—'氯化钙溶液，显色、混匀，过滤到比色试管中，与样品一起在410nm测定吸光度A，；此标准系列含对硝基苯酚的浓度分别为0、1、2，3、4和5吗toL—'。以对硝基苯酚溶液的系列含量和测定的吸光值A'制作工作标准曲线，得到斜率b。4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述反应终止液为7>-:1':1"-TT1ATV/TA迈、/■+!、、,？t——"■￥义廿fe"甘P口，ki."T-TZ^lftl画,lzl+lH/i义.i土丄n/\ivi么友门？廿？i义，亇小axi厶zg二大i巫安、巫T'wriJouuiiil-紫k甶/j、卜r'，用0.5mol.L"的NaOH调节pH至12.0，用蒸馏水定容到1000mL。全文摘要本发明涉及一种检测土壤中芳基硫酸酯酶活性的分析方法1)分别称取土样置于2n个三角瓶中，向三角瓶中加入4ml缓冲溶液，向第一组n个三角瓶中加入1ml底物对硝基苯硫酸钾溶液，第二组n个三角瓶作为对照组，摇匀，盖好瓶塞后恒温培养；2)培养结束后，向三角瓶中加入4ml碱性三羟基氨基甲烷溶液和1ml氯化钙溶液终止反应并显色，并向第二组对照组加入1ml底物溶液，混匀，过滤；3)在410nm处比色测定滤液的吸光度值A；4)根据标准曲线计算对硝基苯酚含量，进而计算芳基硫酸酯酶酶活性。本发明简化了操作步骤，减少了实验过程中的不确定性；减少对设备要求的依赖性；方法准确度高，易操作；结果稳定可靠，重现性好。文档编号G01N21/31GK101625310SQ20081001224公开日2010年1月13日申请日期2008年7月9日优先权日2008年7月9日发明者张玉兰,武志杰,陈利军,陈振华申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所