专利名称：：一种检测土壤酸性磷酸单酯酶活性的分析方法
技术领域：
：本发明涉及土壤中磷酸单酯酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤屮磷酸单酯酶活性的分析方法。技术背景土壤中的磷酸单酯酶能将在土壤磷代谢过程中形成的有机磷酯水解成正磷酸盐，参与有机磷的脱磷过程，成为可被微生物和作物利用的有效态。在pH4—9的土壤中均有磷酸单酯酶，多以积累态存在。磷酸单酯酶可水解对硝基苯磷酸盐，通过比色法测定反应后释放的对硝基苯酚的含量，来估算磷酸单酯酶的活性。酸性和碱性磷酸酶的活性可以通过控制反应的pH值来分别测定。对硝基苯磷酸盐磷酸单酯酶一对硝基苯酚因此，土壤中磷酸单酯酶活性的强弱影响到土壤磷代谢过程中磷素损失的大小，间接影响磷肥的利用效率。土壤磷酸单酯酶对土壤磷素的有效性具有重要作用，可以表征土壤磷酸转化方向和强度。土壤中磷酸单酯酶的活性受土壤条件如水分、温度、土壤质地等的强烈影响，同时也受农田耕作制度、管理措施以及不同作物的影响。因此，对土壤中磷酸单酯酶活性的检验具有重要的意义。目前有关磷酸单酯酶活性的测定虽然已经形成一个相对可靠的方法，但仍然具有一定的缺陷，造成不同土壤类型测定的差异性，以及不同培养批次的差异性和不确定性，难以定性比较和定量研究土壤中磷酸单酯酶活性，降低了实验效率。
发明内容本发明的目的在于提供一种土壤中磷酸单酯酶活性的检测方法。在借鉴其它酶测定方法原理的基础上，该方法根据磷酸单酯酶的特性，对其测定步骤和显色方法进行改进。该方法减少了试验步骤的不稳定性，使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。为实现.t.述目的，本发明采用的技术方案为一种检测土壤中酸性磷酸单酯酶活性的分析方法，l)分别称取1-2&鲜土样品211份分别置入211个500^三角瓶中，论3，分成二组，每组n个，向二组2n个三角瓶中加入0.2-0.4mi分析纯甲苯和4-8mlpll6.45-6.55缓冲溶液试剂，向第-一组n个三角瓶中加入1—2mL25-50mmoL.L—'的底物对硝基苯磷酸二钠工作液，以第二组n个三角瓶中作为样本对照，混匀，盖好瓶塞，放在36.5-37.5T:恒温培养箱中恒温培养1-2h:2)培养结束后，向所有三角瓶中加入4-8mL0.09-O.llmoL'L'pH11.5-12.5的碱性三羟基氨基甲烷溶液和1-2mL0.25-0.5moL'L"氯化钙溶液，向样木对照组n个三角瓶中添加1-2mL25-50mmoL'L—1的底物对硝基苯磷酸二钠工作液，混匀，过滤；试验中加入的碱性缓冲液溶液是用来终止酶促反应，抑制磷酸单酯到磷酸的反应，且不会产生强碱对土壤有机质的分解作用而对产物测定产生颜色千扰，同时避免在一定时间内产生沉淀而影响测定。3)用分光光度法于410nm处分别测定上述所得三角瓶中溶液的吸光度A;以对硝基苯酚溶液标准溶液，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和其分别用分光光度法在410nm测定的吸光值A'制作工作标准曲线，得到斜率b;根据吸光值A和斜率b，计算所测定滤液中对硝基苯酷的浓度S，S=A*b;计算样品中对硝基苯酚含量m,;4)计算磷酸单酯酶酶活性计算公式为w=mi/(m2xK)3吗(:61"151\1〇3'^干土'11-|式中W:单位土壤单位吋间内对硝基苯酚的产生量；ml:测试溶液中对硝基苯酚的质量，样品测定吸光值折换的产物质量值；m2:鲜土样品质量；k:水分系数，单位重量的烘干土重/鲜土重。当步骤3)中的待测液颜色明显超过制作标准曲线最高浓度吋溶液的颜色，表明其中对硝基苯酚含量过高，则用原缓冲溶液稀释5-10倍后再进行比色，若颜色还是过深(目测比对制作标准曲线最高浓度时的溶液颜色)，则重复上述稀释过程；最终再用分光光度法于410nm处测定溶液的吸光度A。所述制作工作标准曲线过程为称取IOOOmg对硝基苯酚溶解于lL蒸馏水中，制备标准贮备液；吸取标准贮备液lmL，定容到100mL，此为0.01mgmL"对硝基苯酚的溶液；再分别吸取该液0、1、2、3、4、5mL于试管中，用蒸馏水补足到相同体积5mL，加入4mL0.1moL，L—1碱性THAM(三羟基氨基甲烷)缓冲溶液和1mL0.5moL.L—1氯化钙溶液，显色、混匀，过滤到比色试管中，与样品一起在410nm测定吸光度A，；此标准系列含对硝基苯酚的的浓度分别为0、1、2，3、4和5(ig'mL"(量为0，10，20，30、40和50吗)，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和测定的吸光值A'制作工作标准曲线，得到斜率b。所述碱性THAM缓冲溶液的配制过程为称取12.2g三羟甲基氨基甲烷(THAM)于800mL蒸馏水中，用0.5molL"的NaOH调节pH至12.0，用蒸馏水定容到1000mL。本发明方法改进的依据土壤中的磷酸单酯酶是参与土壤中e—甘油磷酸酯、苯磷酸酯、P—萘磷酸酯、硝基苯磷酸酯等的水解的一类酶的总称，在测定过程中分解底物对硝基苯磷酸二钠生成对硝基苯酚，需要加入氢氧化钠和氯化钙终止反应并显色。一定浓度的氢氧化钠加入土壤溶液中会造成土壤有机质分解，生成产物呈褐色，在一定程度上影响比色结果。本试验中添加碱性三羟基氨基甲垸溶液即可避免土壤有机质分解，减少颜色干扰，同吋避免在测定过程中产生大量碳酸钙沉淀而影响测定的稳定和准确。本发明所使用的测定原理为土壤中的磷酸单酯酶能够水解对硝基苯磷酸盐，通过比色法测定反应后释放的对硝基苯酚的含量，来估计磷酸单酯酶的活性。本试验拟通过反应后对硝基苯酚C6H5N〇3的生成量来表征土壤磷酸单酯酶活性。酸性和碱性磷酸酶的活性通过控制反应的pH值来分别测定。测定酸性磷酸酶活性时，溶液的pH值为6.5。与其它酶的分析方法相比较，本发明的优点主要有1)所需设备简单、降低了试验成本。本发明中的培养试验是在50mL的三角瓶中进行，培养结朿后直接过滤到15ml试管中。2)所使用的方法显色简单，提高了样品测定的准确度。3)操作简单，减少操作过程的复杂性；分析结果稳定可靠，重现性好。该酶的其它测定方法中需要设置灭菌土壤作为对照，本方法只需要不加底物的样品对照。同时，由于本发明所涉及到的显色步骤减少了土壤有机质碱解形成的颜色以及显色步骤产生的碳酸钙沉淀对测定结果的影响而导致不确定性，故分析结果重现性非常良好。具体实施方式试剂配制1)对硝基苯磷酸二钠溶液(0.05mol.L—称取0.9303g六水对硝基苯磷酸二钠溶于40mLpH6.5的缓冲溶液，然后用同一种缓冲溶液稀释至50mL，低温贮存备用。2)缓冲溶液(pH6.5):称取12.1g三(羟甲基)氨基甲烷、11.6g丁烯二酸、14.0g柠檬酸和6.3g硼酸于488mL氢氧化钠溶液[C(NaOH)=lmol丄力中，然后用水稀释到1L，低温贮存备用；取出200mL上述溶液至1000mL烧杯中，用盐酸(O.lmol'L")溶液调至pH6.5。3)甲苯，分析纯。4)0.5mol'L一1CaCl2溶液称取73.5gCaCl2.2H20溶解于700mL水中，用水定容到1L。5)碱性THAM溶液(0.1mol.L"，pH12):溶解12.2g三羟甲基氨基甲垸(THAM)于800mL蒸馏水中，用0.5molL"的NaOH调节pH至12.0，用蒸馏水定容到lOOOmL。6)对硝基苯酚标准溶液溶解1000mg对硝基苯酚于700mL水中，稀释至1L，放于4X:冰箱低温保存，保存时间不宜过长，以不超过4周为且。操作步骤1)分别称取1.2g鲜土样品12份分别置入12个50mL三角瓶中，向所有三角瓶中分别加入0.25ml甲苯和4ml缓冲溶液，向第一组6个三角瓶中加入1mL50mmoL.L—'的底物对硝基苯磷酸二钠工作液，第二组6个三角瓶作底物试剂对照；混匀，盖好瓶塞，放在37"C恒温培养中恒温培养lh:2)培养结束后，向所有三角瓶中加入4mL0.1moL'L」碱性THAM(三羟基氨基甲垸)溶液和1mL0.5moLL"氯化钙溶液，并向对照组三角瓶中加入lmL50mmoLL"的底物对硝基苯磷酸二钠工作液，混匀，过滤；试验中加入的碱性THAM溶液是用来终止酶促反应并加以显色，抑制对硝基苯硫酸酯到对硝基苯酚和硫酸根的反应，且不会产生强碱对土壤有机质的分解作用而对产物测定产生颜色干扰，同时避免测定过程中产生碳酸钙沉淀而影响测定的稳定和准确。3)用分光光度计于410nm处测定吸光度A，观察待测液颜色，超过标准曲线最高浓度显色液体的颜色，用pH6.5缓冲液稀释后再进行比色；4)制作工作标准曲线称取1000mg对硝基苯酚溶解于lL蒸馏水中，制备标准贮备液。吸取标准贮备液1mL，定容到100mL，此为10吗mL—1对硝基苯酚的溶液。再分别吸取该液0、1、2、3、4、5mL于试管中，用蒸馏水补足到相同体积5mL，加入4mL碱性THAM(三羟基氨基甲烷)溶液(0.1moL-L")禾B1mL氯化转(0.5moL-L")溶液，显色，混匀，过滤到比色试管中，与样品一起在4i0nm处测定吸光度A'。此标准系列含对硝基苯酚的浓度分别为0、1、2，3、4禾卩5|_ig'm!/1(量为0，10，20,30、40和50路)，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和测定的吸光值A'制作工作标准曲线，得到斜率b。5)根据吸光值A和斜率b，计算所测定滤液中对硝基苯酚的浓度S(S=A*b);计算样品中对硝基苯酚含量m1;6)计算磷酸单酯酶酶活性计算公式为w二m,/(m2xK)=^igC6H5N03'g-kRdr.h"本发明操作过程1)简化了操作步骤，减少了实验过程中的不确定性；2)减少对设备要求的依赖性；3)方法准确度高，易操作；4)结果稳定可靠，重现性好。实施例1本实施例所使用的黑土采自于中国科学院海伦生态试验站，设三个不同的处理l号为对照，即不经过任何添加剂的处理的土壤在25'C培养21a+48h以上的普通土壤；2号为土壤在25C培养21a添加土壤调理剂还原型谷胱甘肽且在25r培养48h以上的土壤；3号为土壤在25T培养21a添加土壤调理剂腐殖酸且在25。C培养48h以上的土壤。土壤水分系数均为20%(以烘干土重/鲜土重)。2号和3号土壤中，调理剂的添加量是士壤重量的0.4%，用上述方法检测二种处理的磷酸单酯酶活性。每种土壤的具体分析步骤如下1)分别称取1.2g鲜土样品12份分别置入12个50mL三角瓶中，向12个三角瓶中加入甲苯0.25ml和4mlpH缓冲溶液作试剂，向其中6个三角瓶中加入50mmoL'L—1的底物对硝基苯磷酸二钠工作液1mL，另外一组6个三角瓶不加底物溶液，作为试剂对照；将所有三角瓶中液体混匀，盖好瓶塞，放在37'C恒温培养中恒温培养lh;2)培养结束后，取下瓶塞，向12个三角瓶中都加入4mL0.1moL.L/'碱性(pH12)三羟基氮基甲烷溶液和1mL0.5moL.L"氯化钙溶液，向对照组6个三角瓶加入1mL的50mmoL.U1的底物对硝基苯磷酸二钠工作液底物溶液，混匀，过滤；3)用分光光度计于420nm处测定吸光度A，如待测液中对硝基苯酚含量过高，则用原缓冲液稀释后再进行比色；4)制作工作标准曲线称取1000mg对硝基苯酚溶解于lL蒸馏水中，制备标准贮备液。吸取标准贮备液lmL，定容到100mL，此为10昭mL'1对硝基苯酚的溶液。再分别吸取该液0、K2、3、4、5mL于试管中，用蒸馏水补足到相同体积5mL，加入4-20mL碱性三羟基氨基甲烷溶液(0.5moL'L—')和l一5mL氯化鈣(0.5moL'I/1)溶液，显色、混匀，过滤到比色试管中，与样品一起在410nm处测定吸光度A，。此标准系列含对硝基苯酚的浓度分别为O、1、2,3、4禾Q5(ig-ml/1(量为0，10，20，30、40和50昭)，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和测定的吸光值A'制作工作标准曲线，得到斜率b。5)根据吸光值A和斜率b，计算所测定滤液中对硝基苯酚的浓度S(S=A*b);计算样品中对硝基苯酚含量m,;6)计算磷酸单酯酶酶活性试验结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表中数据可以看出，各处理之间结果差异达到显著水平，较小的标准差值表明该分析方法结果之间的偏差较小，精确度较高，重现性好。且待测定液体放置l一3小吋没有沉淀产生，保证了测定的稳定性。实施例2本实施例所使用的三种不同种植作物的潮棕壤均采于中国科学院沈阳^:态实验站其中4号土壤前茬作物为水稻，5号土壤前茬作物为玉米，6号士壤前茬作物为大豆。三种不同耕作制度的土壤均保持含水量为20%(烘干土重)，在温度为25'C的条件下培养48h以上，测定其磷酸单酯酶活性，具体步骤如下测定步骤同实例l。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表中数据同样显示了分析结果的稳定性及较高的精密度。且待测定液休放置l一3小吋没有沉淀产生，保证了测定的稳定性。本发明优点为l)简化了操作步骤，减少了实验过程中的不确定性；2)减少对设备要求的依赖性；3)方法准确度高，易操作；4)结果稳定可靠，重现性好。权利要求1.一种检测土壤中酸性磷酸单酯酶活性的分析方法，其特征在于1)分别称取1-2g鲜土样品2n份分别置入2n个三角瓶中，n≥3，分成二组，每组n个，向二组2n个三角瓶中加入0.2-0.4ml分析纯甲苯和4-8mlpH6.45-6.55缓冲溶液试剂，向第一组n个三角瓶中加入1-2mL25-50mmoL·L-1的底物对硝基苯磷酸二钠工作液，以第二组n个三角瓶中作为样本对照，混匀，盖好瓶塞，放在36.5-37.5℃恒温培养中恒温培养1-2h；2)培养结束后，向所有三角瓶中加入4-8mL0.95-0.15moL·L-1pH＝11.5-12.5的碱性三羟基氨基甲烷溶液和1-2mL0.25-0.5moL·L-1氯化钙溶液，向样本对照组n个三角瓶中添加1-2mL25-50mmoL·L-1的底物对硝基苯磷酸二钠工作液，混匀，过滤；3)用分光光度法于410nm处分别测定上述所得三角瓶中溶液的吸光度A；以对硝基苯酚溶液标准溶液，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和其分别用分光光度法在410nm测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b；根据吸光值A和斜率b，计算所测定滤液中对硝基苯酚的浓度S，S＝A*b；计算样品中对硝基苯酚含量m1；4)计算磷酸单酯酶酶活性计算公式为w＝m1/(m2×K)＝SμgC6H5NO3·g-1干土·h-1式中w单位土壤单位时间内对硝基苯酚的产生量；m1测试溶液中对硝基苯酚的质量，样品测定吸光值折换的产物质量值；m2鲜土样品质量；k水分系数，单位重量的烘干土重/鲜土重。2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于当步骤3)中的待测液颜色明显超过制作标准曲线最高浓度时的颜色，表明其中对硝基苯酚含量过高，则用原缓冲溶液稀释5-10倍后再进行比色，若第一次稀释后颜，^，过，，则重复上述稀释过程；最终再用分光光度法于410nm处测定3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述制作工作标准曲线过程为，称取1000mg对硝基苯酚溶解于1L蒸馏水中，制备1mgmL—'标准贮备液；吸取标准贮备液1mL，定容到100mL，此为0.01mgmL"对硝基苯酚的溶液；再分别吸取该液0、1、2、3、4、5mL于试管中，用蒸馏水分别补足到相同体积5mL，加入4mL0.1moLL"碱性三羟基氨基甲烷溶液和1mL0.5moL.L"氯化钙溶液，显色、混匀，过滤到比色试管中，与样品一起在410nm测定吸光度A';此标准系列含对硝基苯酚的浓度分别为0、1、2，3、4和5吗'mL—1，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和测定的吸光值W制作工作标准曲线，得到斜率b。4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述反应终止液为碱性THAM缓冲溶液，称取12.2g三羟基氨基甲烷于800mL蒸馏水中，用0.5molL—1的NaOH调节pH至12.0，用蒸馏水定容到1000mL。全文摘要本发明涉及一种检测土壤中酸性磷酸单酯酶活性的分析方法1)称取鲜土样品二组2n(n≥3)份置于三角瓶中，向三角瓶中加入甲苯和缓冲溶液，向第一组三角瓶中加入1ml底物对硝基苯磷酸二钠溶液，第二组作为样本对照，摇匀，盖好瓶塞后恒温培养；2)培养结束后，向第一组和第二组加碱性三羟基氨基甲烷溶液和氯化钙溶液终止反应并显色，并向第二组加入底物溶液，混匀，过滤；3)用分光光度计在410nm处比色测定吸光度值A；4)根据标准曲线计算对硝基苯酚含量，进而计算磷酸单酯酶活性。本发明优点为1)简化了操作步骤，减少了实验过程中的不确定性；2)减少对设备要求的依赖性；3)方法准确度高，易操作；4)结果稳定可靠，重现性好。文档编号G01N21/31GK101625311SQ20081001224公开日2010年1月13日申请日期2008年7月9日优先权日2008年7月9日发明者张玉兰,武志杰,陈利军,陈振华申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所