Lspr的酶测定的制作方法

专利名称：Lspr的酶测定的制作方法
LSPR的酶测定
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本申请要求2007年1月3日提交的第60/878,617号美国临时申请的 权益，将该临时申请整体并入本文。
背景技术：
基于用于信号放大的酶反应的比色测定由于其便于使用及具有足 够的灵敏度已经广泛应用于临床诊断学领域。酶标记的更新率、所用 的酶底物和酶量决定灵敏度。碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶是两种最 常见的酶标记。前者经常用于与氯化硝基蓝四氮唑(NBT)和/或5-溴-4-氯-3'-吲哚基磷酸酯对曱苯胺盐(BCIP)联用。后者经常与3,3',5,5'-四曱 基联苯胺(TMB)、 4-氯-l-萘酚(4-CN)、 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB) 等联用。在酶底物与所述酶反应时，形成不溶性有色产物。可以用肉 眼观察不溶物以获得定性结果，或利用筒单的光学检测器获得半定量 结果。因此，多少不溶性产物积聚以及光密度随着积聚发生多大变化 决定了检测极限。
已经付诸了许多努力来增加酶作用的效率和开发具有光密反应产 物的底物。通过升高温度来促进酶促反应没有太多余地，因为较高的 温度导致酶的降解。增加酶的量的确有用，但对多少抗体可以结合到 固体表面有限制。用于免疫层析试剂盒的多孔膜已经达到了这种限制， 没有显著的改变可以期待。与比色方法相关的另 一缺点是差的动力学 范围。只要检测方法依赖于吸光度的测量，对于低于2的光密度的精确 测量是可能的，且另一方面最小吸光度是0.1级别。因此，范围只有20， 仅覆盖了一个数量级多点。
尽管肯定会做出改进，但没有 一 个适用于大范围酶/底物结合的通 用方法。本发明令人惊讶地提供了不依赖于对特定酶或底物的改进的 通用方法。发明概述
在一个实施方案中，本发明提供了检测局域表面等离子体共振
(LSPR)检测系统表面的折射率变化的方法。该方法包括利用固定的酶 从酶底物产生不溶性产物，其中所述不溶性产物在LSPR支持表面积
光或透射光的变化。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有第一固体支持物的LSPR 传感器、置于第一固体支持物上的LSPR支持表面、靠近LSPR支持表 面的固定的酶以及酶底物。
附图
简要说明
观'J定(colorimetric 2-step sandwich assay)的比寿交。 图2显示了使用本发明方法的l-步测定。
图3显示了实施酶促反应后，金纳米颗粒的扫描电子显微镜(SEM) 照片(1)以及表示在IL-6测定末，酶促反应过程中光密度变化的图。
图4显示了可将抗体与纳米颗粒(l)、与第 一 固体支持物(2)以及第 二固体支持物(3,4)结合的多种方式。
发明详述 I.总述
本发明提供了通过利用局域表面等离子体共振(LSPR)支持表面检 测分析物的方法。LSPR支持表面包括金包被表面，在该表面上有诸如 珠的金包被的纳米颗粒阵列。本发明的方法利用夹心测定检测分析物。 本发明的方法通过用固定在LSPR支持表面的珠的金表面上的第 一捕 获部分捕获分析物检测所述分析物。然后利用具有检测部分的第二捕 获部分检测所述分析物的存在。
在优选的实施方案中，所述夹心测定是免疫测定，其中捕获部分 是抗体，而分析物是抗原。在另一个优选的实施方案中，检测部分是酶，以使当第二捕获部分结合到分析物时，将可溶性酶底物加入混合
物中，以致该酶将所述酶底物转化为在LSPR支持表面积聚的不溶性产 物。不溶性产物在LSPR支持表面的积聚导致肉眼可见的反射或透射光 的波长位移(wavelength shift)。 LSPR的特性是需要4及少的不溶性产物 来诱发肉眼可见的波长位移。与本发明的方法相比，现有方法直接利 用比色法检测不溶性产物的存在，因此需要大量的不溶性产物沉积。
色酶免疫测定的灵敏度。这通过局域表面等离子体共振效应放大了检 测，通过在低容积反应区搅动样品缩短了测定时间并将动力学范围扩 大到几个数量级之外。
可以通过利用与LSPR支持表面相关的近场光学(near-field optics) 提高比色酶免疫测定的灵敏度。在常规测定中，从酶促反应形成的有 色产物可以通过肉眼检测，或通过监测在特定波长的吸光度的简单装 置检测。如果在LSPR支持表面进行比色酶免疫测定，可以通过检测反 射光或透射光的波长位移来间接检测浓度低得多的有色产物的产生。 在固体表面吸收的纳米颗粒形成了 LSPR支持表面，所述表面的特征在 于4兌消光i普(sharp extinction spectrum)。该4兌消光"i普可以是电,兹光i普的 任一部分，诸如在可见区中。锐消光谱是由于局域表面等离子体现象， 即局域自由电子的集体共振引起的。消光谱显示了对局部折射率非常 敏感的依赖性。通过经由不溶性产物的吸收谱监测不溶性产物在LSPR 支持表面积聚诱发的折射率变化，检测较低浓度的抗原是可能的。
常规比色法依赖于积聚的酶促反应产物的直接光学检测，具有仅 稍高于1个数量级的动力学范围。这已受到大多数光学系统高精确地测 量0.1至1.5范围内的光密度的能力限制。本发明的方法可以在不同的波 长监测LSPR支持表面的消光谱的变化。尽管常规的比色测定已经尝试 了相似的方法，但常规方法使用有色产物的直接监测，而不是如本发 明所实践的间接监测。此外，可以通过操纵物理参数来调整LSPR支持 表面的灵敏度。因此，可以将动力学范围扩展几个数量级。
II.定义
7如本文所使用的，术语"LSPR支持表面"指能通过受限自由电子的 共振荡形成光学近场的表面，所述受限自由电子的共振荡，通常称为 局域表面等离子体共振。LSPR支持表面的特征在于如下文更详细描述 的纳米颗粒。LSPR支持表面可以是不透明的或透明的，且可以透射或 反射光，或即透射光也反射光。
如本文所使用的，术语"纳米颗粒"指直径为约10力至约10—7米的颗 粒和珠。纳米颗粒可以由任何合适的物质制成，且包括但不限于珠、
棱锥、金属丝、网丝等。本领域技术人员会认识到，其它的纳米颗粒 可以用于本发明中。
如本文使用的，术语"过渡金属"指周期表的元素，包括Sc、 Ti、 V、 Cr、 Mn、 Fe、 Co、 Ni、 Cu、 Zn、 Y、 Zr、 Nb、 Mo、 Tc、 Ru、 Rh、 Pd、 Ag、 Cd、 La、 Hf、 Ta、 W、 Re、 Os、 Ir、 Pt、 Au和Ac。本4贞i或 技术人员会认识到，上述的过渡金属的每一种都可以采用几种不同的 氧化状态，所有的状态都用于本发明。在一些实例中，形成了最稳定 的氧化状态，但其它的氧化状态也用于本发明。
如本文使用的，术语"固体支持物"指其上可以添加或形成LSPR支 持表面的任何物质。合适的固体支持物的实例包括，但不限于，玻璃(包 括孔径可调的玻璃聚合物(例如，聚苯乙烯、聚氨基曱酸酯、聚苯乙烯 -二乙烯基苯共聚物)、硅橡胶、石英、乳胶、过渡金属、磁性材料、 二氧化硅、氮化硅、砷化镓以及其衍生物。除了表面的反应位点，固 体支持材料通常抵抗它们接触的各种化学反应条件。用于本发明的固 体支持物可以是平滑的或粗糙的。平滑表面是在表面上具有导致粗糙 的最少特征的表面。粗糙表面是在表面上具有产生磨擦力的大多数特 征的表面。本发明的固体支持物包括第一固体支持物和第二固体支持 物。固体支持物可以是平面的或非平面的、柔性的或刚性的。另外， 固体支持物可以是多孔的网或织品。固体支持物可以是不透明的或透
明的，可以透射或反射光，或既可以透射光又可以反射光。本领域的 技术人员会认识到，其它的固体支持物可以用于本发明。
如本文使用的，术语"LSPR检测系统"指通过监测LSPR支持表面 的折射率的变化检测靶分析物的系统。这些变化可以是等离子体峰移(peak shifts),吸收、反射或透射光i普形状的变化或诸如吸收、反射或 透射光镨的面积或比率的相关度量的变化。
如本文使用的，术语"不溶性产物"指积聚在LSPR支持表面并改变 LSPR支持表面的折射率的化合物。通过利用酶的酶底物的转化形成不 溶性产物。该不溶性产物可以是有色的或无色的。
如本文使用的，术语"酶底物"指可溶性化合物，其通过酶转化为 随后在LSPR支持表面积聚或改变LSPR支持表面的折射率的不溶性产 物。下文描述了用作本发明的酶底物的化合物的实例。酶底物可以是 有色的或无色的。
如本文使用的，术语"固定的酶"指固定在固体支持物上、并靠近 LSPR支持表面、并将酶底物转化为不溶性产物的酶。下文描述了固定 的酶的实例和固定酶的方法。
如本文使用的，术语"免疫测定"指4企测利用两种捕获试剂4全测分 析物的测定，其中一个捕获试剂通常结合到固体支持物材料上且第二 捕获试剂包括检测部分。可以使用多种免疫测定形式，诸如固相ELISA
参见,例如,Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (抗体，实 验室手册)(1988))。可以用于测定分析物的免疫测定包括，例如竟争 性和非竟争性测定系统，诸如Western免疫印迹、放射免疫测定、ELISA (酶联免疫吸附测定)、"夹心"免疫测定、免疫沉淀反应测定、沉淀素反 应(precipitin reactions)、 凝胶扩散沉淀素反应(gel diffusion precipitin reactions),免疫扩散测定、凝集测定(agglutination assays)、补体结合 测定、免疫放射分析、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定等等。本领 域的技术人员会认识到，其它免疫测定可以用于本发明。
如本文使用的，术语"抗体"指基本上由 一个免疫球蛋白基因或多 个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽，其特异性结合和识别分析物 (抗原)。识别的免疫J求蛋白基因包括K、入、a、 7、 S、 e和/i恒定区基因 以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分为K或X。重链分为7、 /x、 a、 S或e,其依次限定免疫球蛋白类别，分别为IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单位包含四聚体。每一四聚体由两个相同的成对多肽《连组成，每一对具有一个"轻"(约25 kD)和一个"重" 链(约50-70 kD)。每一链的N-末端限定主要负责抗原识别的约100至 110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VO和可变重链(VH)分 别指这些轻链和重链。
例如，抗体以完整的免疫球蛋白形式或以众多通过由各种肽酶消 化产生的良好表征的片段形式存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区 的二硫联接(disulfide linkages)下方消化抗体，产生F(ab)、，即Fab的二 聚体，其本身是通过二硫键连接到VH-CH l的轻链。F(ab)'2可以在温和 的条件下被还原以打断铰链区的二硫联接，由此将F(ab)'2二聚体转化 为Fab'单体。该Fab'单体本质上是带有部分铰链区的Fab(参见，Paul (Ed.) Fundamental Immunology (基础免疫学),第三版,Raven Press, NY (1993))。尽管根据完整抗体的消化定义了各种抗体片段，但本领域技 术人员会认识到，这些片^殳可以以化学方法或通过利用重组DNA方法 学从头合成。因此，如本文使用的，术语抗体也包括通过完整抗体的 修饰产生或利用重组DN A方法学从头合成的抗体片段(例如，单链 Fv)。
如本文使用的，术语"夹心测定"指直接测量捕获的分析物的量的 测定。例如，在一个"夹心"测定中，捕获试剂可以直接结合到固体底 物，它在那里得以固定。然后这些固定的捕获试剂捕获存在于测试样 品中的靶分析物。因此固定的輩巴分析物随后被带有检测部分的第二捕 获试剂结合。可选择地，所述检测部分可以是带标记的第三试剂，其 对衍生第二试剂的种类的试剂是特异的。第二试剂可以由诸如生物素 的可检测的部分修饰，第三标记的分子诸如酶标记的链霉抗生物素可
以特异结合该可;f全测部分。如下文所述的，所述试剂可以是抗体或
adncctins。
如本文所使用的，术语"透明的"指材料透射光的能力。在本发明 中， 一些固体支持材料是透明的，吸收通过所述材料的很少的光。
III.检测局域表面等离子体共振(LSPR)检测系统表面的折射率变化 的方法本发明提供了检测局域表面等离子体共振(LSPR)检测系统表面的 折射率变化的方法。该方法包括使用固定的酶从酶底物产生不溶性产 物，其中所述不溶性产物在LSPR支持表面积聚。该方法也包括利用 LSPR,即利用被LSPR表面反射的或穿过LSPR表面透射的光谱的变 化，检测由不溶性产物存在引起的表面的反射或透射光的变化。
本发明的基本原理是基于由与纳米级贵金属颗粒有关的局域表面 等离子引起的增强效应。在直径为5nm至1000nm的这些颗粒中，产生 了由受限的自由电子的共振荡导致的显著的消光。共振电子产生了强 烈的局域电/f兹场，与非局域化的表面等离子体相比，强度增加了几个 数量级。局域场，通常称为光学近场(optical near-field),从表面延伸 几十nm。当近场内的折射率变化时，由颗粒导致的消光被极为壽丈感地 修正。利用这种灵敏度，本发明提供了用于在LSPR附近进行比色的酶 测定方法。当产物沉积于LSPR支持表面时，消光谱的变化足以用肉眼 检测，甚至当沉积厚度低于10nm时。监测的不是酶产物的吸光率。而 是LSPR支持表面的消光谱的变化，其易受LSPR附近产物存在的影响。 可以基于需要的灵敏度选择待监测的波长。较接近波峰的波长区间20 至50nm适用于高灵敏度，且更远的那些适用于较低灵敏度。因此，通 过在多重波长或全光谱的监测，延伸动力学范围是可能的。
尽管有许多形成表面吸附的颗粒的方法，本发明的方法利用通过 单分散颗粒的单层首先在固体支持物培育的贵金属表面吸附的步骤。 固体支持物可以是任何合适的材料，诸如硅、玻璃或聚合物。另一种 贵金属层沉积在纳米颗粒单层的顶部。通过仔细选择纳米颗粒直径和 贵金属层的厚度，产生其消光峰可以与待检测的整个范围的光的任一 波长匹配的LSPR支持表面是可能的。例如，可见光谱的任一波长可以 以这种方式匹配。而且，LSPR支持表面的不同纳米颗粒直径显示了不 同的灵敏度，以致使用多个类型和直径的颗粒可以用于进一步扩展动 力学范围。本发明的颗粒包括，但不限于，由贵金属和其他物质构成 的球形、三角形或颗粒，所述其它物质即由聚合物、金属、金属合金 或非金属合成物制成的物质，本发明的颗粒可以是空的或多孔的，或 是有芯的，内部是不同的材料、液体或物质且具有5nm至100um的直
ii径、长度或质量，其可以通过使用掩模和/或移除掩模的机械的、真空 的或化学方法被组成图案。
A. LSPR支持表面
本发明的LSPR支持表面能检测LSPR支持表面的消光谱的变化， 其中消光谱对产物的存在是敏感的。通过经由LSPR支持表面的吸收谱 监测由不溶性产物的存在诱发的折射率的变化，检测较低浓度的抗原 是可能的。
图l描述了以常规方法和本发明的方法实施的2-步夹心比色测定。 在通常情形下，方法起始于抗体包被的表面(1)。加入包含靶分子(抗原) 的样品启动表面结合抗体和抗原的结合事件(2)。然后，加入酶联二抗 (3)。底物的加入导致有色酶促反应产物的形成(4)。通过在表面形成多 少有色产物来确定存在于样品中的抗原的量(5)。在本发明的方法中， 方法起始于带有固定的抗体的金颗粒包被的表面(6)。加入包含抗原的 样品进行第一抗原/抗体反应(7)。加入二抗(8)，并加入底物，进行酶 促反应(9)。最后，通过金颗粒的消光谱的变化确定抗原的量(IO)。总 位移朝向较长的波长。监测不同波长的光谱位移或全光谱使技术人员 能够调整灵敏度。
图2显示了如何实施称为l-步测定的可选择免疫测定模式。关于该 测定，当抗原和二抗还自由悬浮在液相中时，使两者形成抗原/二抗复 合物。该复合物被表面接合的抗体捕获(2)。如图l中的2-步测定，通过 监测金颗粒的消光谱的变化进行检测(3)。 1-步测定适用于需要较短测 定时间的测试。
图3 (1 )显示了进行酶促反应后的金颗粒的扫描电子显微镜(SEM) 照片，标记是碱性磷酸酶，且底物是NBT和BCIP的混合物。颗粒直径 为100nm,且颗粒周围的壳是酶促反应的沉积的产物。据估计沉积物 的厚度为约20nm。 (2)是表示IL-6测定末，酶促反应过程中光密度的最 大位置的变化图。金颗粒的消光谱的峰值为570 nm,且监测的波长范 围是620至630 nm。在t二50秒时注射BCIP/NBT底物混合物。从顶端到 底端，抗原浓度是60、 6、 0.6、 0.06ng/ml。LSPR支持表面可以包括可以是排列的、组成图案的或分层的其任 一组合的纳米颗粒。纳米颗粒可以是任意大小和形状，诸如胶体、网 丝、纳米棒、纳米线和珠。纳米颗粒可以是单层或多层纳米颗粒。在 一些实施方案中，纳米颗粒形成单层。
LSPR支持表面的纳米颗粒可以由单一物质或物质的混合物制成。 当所述纳米颗粒由物质的混合物制成时，所述混合物可以是均质的或 异质的，以使纳米颗粒内形成2层或多层材料。所述纳米颗粒可以是中 空的或多孔的。所述纳米颗粒可以使不透明的或透明的，并能够透射 或反射光，或既透射光又反射光。
于本发明的纳米颗粒的材料的实例包括但不限于，金属、聚合物、陶 瓷(诸如^f圭石)和玻璃。
在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒包括过渡金属，所述过渡 金属包4舌Sc、 Ti、 V、 Cr、 Mn、 Fe、 Co、 Ni、 Cu、 Zn、 Y、 Zr、 Nb、 Mo、 Tc、 Ru、 Rh、 Pd、 Ag、 Cd、 La、 Hf、 Ta、 W、 Re、 Os、 Ir、 Pt、 Au和Ac。本领域的技术人员会认识到，上文描述的过渡金属的每一种 可以采取几种不同的氧化状态，所有状态都可以用于本发明。在一些 实例中，形成了最稳定的状态，但其它氧化状态也用于本发明。此外， 本发明的过渡金属可以是金属氧化物。在一些实施方案中，过渡金属 可以是Au、 Ag、 Ta、 Pt、 Pd、 Cu或Rh。在其它实施方案中，过渡金 属可以是金。
适的聚合物。在一些实施方案中，所述聚合物可以是聚苯乙烯、聚曱 基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯。在一些实施方案中，纳米颗粒可以是玻璃 或包括聚苯乙烯、聚曱基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯在内的聚合物。用作 本发明的纳米颗粒的陶瓷可以是任何陶覺。在一些实施方案中，所述 陶瓷可以是Si02或玻璃。
在其它实施方案中，材料的混合物用作LSPR支持表面的纳米颗 粒。可以使用任何组合的材料。在一些实施方案中，纳米颗粒可以是 包被金的聚苯乙烯或包被金的玻璃。本领域的技术人员会认识到，其
1它材料可用作本发明的纳米颗粒。
在另一个实施方案中，LSPR支持表面的每一纳米颗粒是具有顶部
和底部的i朱，其中顶部包被有过渡金属。在其它实施方案中，纳米颗 粒珠是聚苯乙烯，且过渡金属是金。当本发明的纳米颗粒珠是包被的， 诸如包被金的玻璃珠时，包被层可以是任何有益的厚度。在一些实施
方案中，金包被层的厚度可以是l nm或更小，几纳米或上百纳米。使 用本领域技术人员已知的技术，诸如蒸发、賊射和CVD可以实现纳米 颗粒的包被。
本发明的LSPR支持表面的纳米颗粒可以是任意大小和尺寸。在一 些实施方案中，纳米颗粒的大小是5nm至约1000nm。在一些其它的实 施方案中，珠的直径为约10nm至约1000nm。仍在一些实施方案中， 所述珠的直径为约50nm至约500nm。本领域的技术人员会认识到，其 它大小和尺寸的纳米颗粒可以用于本发明。
用于本发明的LSPR支持表面的纳米颗粒的大小和形状，允许 LSPR支持表面得以调整，以与诸如可见光的全范围的任意波长匹配。 也可以利用用于纳米颗粒的不同形状、大小和材料调整LSPR支持表面 的动力学范围和灵敏度。
本发明的固体支持物可以是支持LSPR支持表面的任意材料。用于 固体支持物的材料包括，但不限于，过渡金属、陶瓷、聚合物和玻璃。 本领域的技术人员会认识到，其他材料可以用于本发明。
可以通过诸如使表面平滑或使表面粗糙修饰固体支持物的表面以 获得纳米级特征。在一些实施方案中，固体支持物包被有过渡金属， 诸如上文所述的过渡金属。在一些其它的实施方案中，固体支持物包 被有金。包被层可以是任意有益的厚度，从小于lnm、包括几纳米直 到最多数百纳米。
LSPR支持表面和固体支持物材料在用于检测LSPR支持表面的折 射率变化的光的波长处可以是不透明或透明的。在一些实施方案中， 折射光用于^r测LSPR支持表面的折射率的变化。在一些实施方案中， 透射光用于检测LSPR支持表面的折射率的变化。在一些其它的实施方 案中，折射光和透射光都用于检测不溶性产物的存在。B.测定、酶和酶底物
部分捕获，然后4吏用一全测部分检测。通常，它是包含捕获试剂和检测 试剂的夹心测定。最通常的是，所述试剂是抗体，但它们可以是激素 受体、adnectins或分析物结合试剂的任何其它组合。
在一些实施方案中，所述测定是免疫测定。可以使用的多种免疫 测定，包括但不限于，固相ELISA免疫测定(对于免疫测定形式和可以 用于确定特异性免疫反应条件的描述，参见，例如Harlow & Lane， Antibodies, A Laboratory Manual (抗体，实'验室手册)(1988))。可以用 于检测分析物的免疫测定包括，例如，竟争性和非竟争性测定系统， 诸如Westem免疫印迹、放射免疫测定、ELISA (酶联免疫吸附测定)、 "夹心"免疫测定、免疫沉淀反应测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素 反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射分析、荧 光免疫测定、蛋白A免疫测定等等。在优选的实施方案中，所述测 定是诸如ELISA测定的夹心测定。ELISA测定包括将未知量的抗原附 着于表面，然后使特异性抗体流过所述表面，以使它能够结合所述抗 原。该抗体与酶连接，且在最后步骤中，加入酶能够将其转化为一些 可检测信号的物质。因此，在焚光ELISA的情形下，当光照到样品上 时，任何抗原/抗体复合物会发焚光以使样品中抗原的量能得以测量。
实施ELISA包括至少一种对特定抗原具特异性的抗体。将带有未 知量抗原的样品非特异(通过吸附到表面)或特异(在"夹心"ELISA中， 通过被特异于相同抗原的另 一种抗体捕获)地固定在固体支持物上。抗 原被固定后，加入检测抗体，与抗原形成复合物。可以将检测抗体与 酶共价连接，或自身可以被通过生物结合连接到酶的二抗检测。在每 一步之间，板通常用温和的去垢剂溶液洗涤以去除没有特异结合的任
何蛋白或抗体。最后的洗涤步骤后，通过加入酶底物使板显色以产生 可见信号，其指示样品中抗原的量。
用于本发明的酶是将可溶性化合物转化为不溶性化合物的酶。用 于本发明的酶的实例包括但不限于，碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。本领域的技术人员会认识到，其它酶也可以用于本发明。
化合物的酶底物。在一些实施方案中，可溶性化合物没有颜色且不溶 性化合物是有色的。酶底物的实例包括但不限于，氯化硝基蓝四氮唑
(NBT)、 5-溴-4-氯-3'-吲哚基磷酸酯对曱苯胺盐(BCIP)、 3,3',5，5'-四曱基 联苯胺(TMB)、 4-氯-l-萘酚(4-CN)和3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐 (DAB)。其它的酶底物包括称为ECL和ECL Plus的电化学发光 (ElectroChemiLuminescent)化学制品。本领域的技术人员会认识到，其 它的酶底物可以用于本发明。
在其它的实施方案中，所述酶通过连接到抗体固定。在一些其它 的实施方案中，所述酶经由夹心测定固定。
许多不同的方法可以用于定位捕获试剂。最简单的方法是将试剂 直接置于LSPR支持表面的表面。将捕获试剂连接到明显不同于金颗粒 的表面也是可能的。该表面永久地或仅在酶反应的持续时间固定在相 对于金颗粒的位置。例如，捕获试剂可以固定在固体支持物上，或固 定在如磁珠的第二固体支持物上。在一些实施方案中，捕获试剂是抗 体。
本发明的酶可以以任何合适的方式固定于纳米颗粒或固体支持 物。所述酶的固定可以是通过形成共价键、形成离子键、氢键和范德 华力等。图4显示了抗体被结合的多种方式。抗体可以直接连接到(l) 中LSPR支持表面的纳米颗粒的顶端或连接到靠近纳米颗粒的单独区 域(2)。可选择地，抗体可以连接到能够置于靠近抗体包被的表面处的 单独表面，其中支持表面被制成多孔的以及透明的，以确保抗原能接 触抗体并允许询问光(interrogating light)达到抗体包被的表面。另 一种 方法利用抗体包被的磁珠，所述珠可以通过外磁体(external magnet)(4) 与金颗粒包一皮的表面发生联系。酶促反应产物沉积后，可以移走磁珠 以便于光学读数。将抗体连接到单独的表面的优点是增加了信号；当 酶促反应产物在棵LSPR支持表面而不是已被抗体覆盖的LSPR支持表 面沉积时，这种变化更大。
在另一实施方案中，LSPR支持表面位于第一固体支持物上。在其他实施方案中，酶固定在第--固体支持物上。在一些其它的实施方案 中，酶固定在第二固体支持物上，其中在产生步骤中，所述第二固体
支持物靠近LSPR支持表面。仍在其它的实施方案中，所述第二固体支
持物是透明的。仍在其它的实施方案中，所述第二固体支持物是磁珠。 在另一个实施方案中，第一固体支持物的表面是平滑的。仍在另一个 实施方案中，第一固体支持体的表面是粗糙的。
用于要求保护的本发明中的诸如磁乳胶珠和氧化铁颗粒的石兹珠或
颗粒，是本领域技术人员已知的。例如，在U.S. Pat. No. 4，672,040中 描述了》兹性颗粒。磁性颗粒可以从例如PerSeptive Biosystems, Inc. (Framingham Mass.), Ciba Coming (Medfield Mass.)、 Bangs Laboratories (Carmel Ind.)以及BioQuest, Inc. (Atkinson N,H.)商购。
已经开发出以与抗体相似的方式耙向并结合耙标的其它化合物。 这些"抗体模拟物"中的某些利用非免疫球蛋白支架作为抗体可变区的 可选择性蛋白框架。
例如，Ladner等(U.S. Patent No. 5,260，203)描述了具有结合特异性 的单一多肽链结合分子，所述结合特异性与聚合的、但分子上分离的) 抗体的轻链和重链可变区的结合特异性相似。单链结合分子包含由肽 连接子连接的抗体的重链和轻链可变区的抗原结合部位，其折叠成与 双肽抗体(two peptide antibody)相似的结构。单链结合分子显示了优于 常规抗体的几个优点，包括较小的体积、更大的稳定性以及更易修饰。
Ku等(尸麼.淑/. ^SW. ".S乂 92(14):6552-6556 (1995))公开了
基于细胞色素13562的抗体的替代物。Ku等(1995)制备了其中细胞色素 1)562的两个环被随机排列并基于与牛血清白蛋白的结合进行选择的文 库。发现个别的突变体选择性地与BSA结合，与抗-BSA抗体相似。
Lipovsek等(U.S. Patent Nos. 6，818，418和7，115,396)公开了抗体模 拟物，其以纤连蛋白或纤连蛋白样蛋白支架以及至少一个可变环为特 征。这些基于纤连蛋白的抗体模拟物称为Adnectins，显示了天然的或 经改造的抗体的许多相同特征，包括对任一靶向配体的高亲和力和特 异性。设计新的或改良的结合蛋白的任何技术都可以用于这些抗体模 拟物。这些基于纤连蛋白的抗体模拟物的结构与IgG重链可变区的结构 相似。因此，这些模拟物显示在本质和亲和力上与天然抗体相似的抗 原结合特性。此外，这些基于纤连蛋白的抗体模拟物显示了优于抗体 和抗体片段的某些益处。例如，这些抗体模拟物的天然折叠稳定性不 依赖于二硫键，并因此在通常会降解抗体的条件下是稳定的。此外，
由于这些基于纤连蛋白的抗体模拟物的结构与IgG重链的结构相似，可 以在体外采用环随机化和改组(shuffling)的方法，其与体内的抗体亲和 力成熟方法相4以。
Beste等(/Voc.胸/. Sc丄f/.&左96(5): 1898-1903 (1999))公开
了基于脂质运载蛋白支架(Anticalin⑧)的抗体模拟物。脂质运载蛋白支 架由在蛋白末端带有四个高变环的i8-桶组成。Beste (1999)将所述环随 机突变并根据与例如荧光素的结合进行选择。三种变体展示了与荧光 素的特异性结合，其中一个变异体显示了与抗荧光素抗体相似的结合。
其它的分析表明，所有随机化的位置都是可变的，表明Anticalin⑧适于 用作抗体的替代物。
Anticalins⑧是小的单链肽，通常为160至180个残基，其提供了优 于抗体的几个优点，包括降低的生产成本、增加的存储稳定性和降低 的免疫学反应。
Hamilton等(U.S. Patent No. 5,770,380)公开了利用杯芳烃的刚性非 肽有机支架的合成抗体模拟物，其与作为结合部位的多个可变肽环连 接。肽环在几何学上都从杯芳烃的同一侧突出，彼此不接触。由于这 种几何构型，所有的环都可以用于结合，从而增加了对配体的结合亲 和力。然而，与其它抗体模拟物相比，基于杯芳烃的抗体模拟物并不 仅由肽组成，因此它较不易受蛋白酶的攻击。支架也不是完全由肽、 DNA或RNA组成，这意味着该抗体模拟物在极端环境条件下相对稳 定，寿命长。此外，既然基于杯芳烃的抗体模拟物相对较小，它不大 可能产生免疫原性反应。
Murali等(Ce〃 Mo/所o/ 49(2):209-216 (2003))讨论了将抗体降解为 更小的模拟肽(peptidomimetics)的方法，它们称为"抗体样结合模拟肽 "(ABiP)，也可以作为抗体的替代物。
18除了非免疫球蛋白的蛋白框架外，在包含RNA分子和非天然寡聚 体的化合物(例如，蛋白酶抑制剂、苯二氮卓类、嘌呤衍生物和/3-转角 模拟物)中，也模拟了抗体特性。
将酶连接到表面的其它方法包括，使用同源双功能 (homobifunctional)和异源双功能(heterobifunctional)连接子。零长交耳关 剂(Zero-length cross linking reagents)i秀导两个配体的直接偶耳关，而不引 入任何外来物质。催化二硫键形成的试剂属于这类。另一个实例是诱 导羧基和第一位氨基缩合以形成酰胺键的试剂，诸如碳二亚胺、氯曱 酸乙酯、伍德沃氏(Woodward's)试剂Kl、羰基二咪唑等。同源双功能 试剂携带两个相同的功能基团，而异源双功能试剂包含两个不同的功 能基团。大多数异源双功能交联剂包含第 一位胺反应基团和硫醇反应 基团(thiol-reactive group)。 Heindel等(Heindel， N. D. et al., Bioconjugate Chem. 2， 427-430 (1991))公开了曱酰与硫醇偶联的新异源双功能连接 子。在优选的实施方案中，共价交联剂选自能形成二硫(-S-S-)、乙二 醇(誦CH(OH)-CH(OH)-)、偶氮(-N二N-)、亚枫(-S(-02)-)或酯(-C(-0)-0-) 键的试剂。
在不同的方法中，配体通过其寡糖连接。多肽配体上的寡糖化学 氧化或酶促氧化成醛，在该分子上产生了独特的功能基团，其可以与 包含例如胺肼、酰肼、氨基脲的化合物反应。由于糖基化位点在多肽 分子中是明确的，通过氧化的寡糖部分的选择性偶联会比其它偶联方 法产生更为均一的产物，且被预期对配体的受体结合特性具有较少副 作用。针对糖类的异源双功能交联剂公开于，例如1992年8月5号提交 的共同未决的专利申请第07/926,077号和美国专利第5，329,029号中。
C.检测
施方案中，检测方法是使用合适装置通过比色检测。在其它实施方案 中，；险测通过肉眼进行。LSPR支持表面的折射率变化的检测在任一波 长处进行，特别是具有约200至约1000nm的波长的光。用于检测LSPR 支持表面的折射率变化的检测仪器包括但不限于，UV-Vis分光计和板读数器。
IV. LSPR传感器
本发明的LSPR传感器包括第 一 固体支持物、如上文所述的并安置 于第 一 固体支持物的LSPR支持表面、靠近LSPR支持表面的固定的酶 以及酶底物。
V. 试剂盒
在一些实施方案中，本发明提供了具有如上文所述的LSPR传感器 和酶底物的试剂盒。本发明的试剂盒也可以包括溶剂、緩沖液、稳定 剂和使用说明书。
VI. 实施例
实例l:检测LSPR表面的折射率的变化
根据下文描述的多种步骤，进行用于LSPR表面的免疫测定的流程。
步骤l.捕获抗体的固定
首先利用本领域已知的方法制备LSPR支持表面，所述方法包括在 玻璃底物上沉积金，随后在金包被的玻璃底物上形成单层聚苯乙烯珠， 且然后在整个表面沉积另一层金。然后用具有以9:1比率混合的羟基链 烷石克醇(hydroxyl-alkanethiol)和羧基链烷碌u醇(carboxyl-alkanethiol)的 自组装单层(SAM)修饰所述金包被的表面。
用溶于水的0.05% Tween20洗涤SAM-官能化的LSPR支持表面。然 后将其用双蒸水冲洗并干燥。如在即Greg T. Hermanson, 5"cc^wga^ JfecAm々證，Academic Press, San Diego， 1996中描述的，用溶液(溶于O.l M MES緩沖液的IOO mM NHS + 400 mM EDC in)激活LSPR支持表面 的羧基基团15至30分钟。
孵育30分钟后，冲洗掉所述溶液并换为500 nM抗体溶液的溶液。 抗体溶液在无胺緩沖液如PBS中。将抗体固定30分钟，最长为24小时。 例如，检测C-反应蛋白的捕获抗体是来自Biodesign的小鼠单克隆的抗CRP抗体Cat弁M86007M。通过使表面与溶于水的50 mM氨基聚乙烯氧
然后表面用水冲洗，并通过在购自Pierce化学公司的StartingBlock 緩冲液中孵育15分钟进一步封闭以对抗非特异性结合。然后将用捕获 抗体活化的LSPR支持表面用双蒸水冲洗并保持在湿润的环境中，直至 使用传感器。
2. 抗原的捕获
将C-反应蛋白或CRP在由磷酸盐緩冲液(PBS)、 lmMCa2+、 0.01% v/v Tween 20和10 uM BSA (牛血清白蛋白)组成的缓冲液中(缓沖液A) 稀释成从l pM (l(T12 M)直到luM (10—6 M)的多种浓度。然后将抗原与抗 体活化的LSPR支持表面一起孵育5分钟至2小时的一段时间。
3. 第二抗抗原抗体捕获
然后将传感器与缓冲液A中的浓度为250 nM的多克隆山羊抗人 CRP抗体(Bethyl Labs, Cat# A80-125A)—起孵育。该抗体可以标记有酶 或探针(例如，生物素)。孵育15至30分钟后，第二抗体用緩沖液沖洗 掉。
4. 针对第二抗抗原抗体的酶耳关抗体
然后使酶联抗体，即驴抗山羊IgG抗体碱性磷酸酶偶联物(Bethyl Lab, Cat# A50-101AP)反应约2至30分钟，随后用緩冲液A沖洗掉。
5. 显色
将酶底物加到LSPR支持表面并孵育30秒至10分钟。未反应的酶底 物用水冲洗掉。然后测量表面的吸收光谱或反射光谱。
尽管出于清楚理解的目的，通过说明和实施例较详细地描述了前 述发明，但本领域的技术人员会认识到，在所附的权利要求的范围内 可以做出某些变化和修饰。此外，本文提供的每一篇参考文献通过引 用的方式整体并入的程度，如同每一篇参考文献通过引用的方式单独 并入。
权利要求
1.检测局域表面等离子体共振(LSPR)检测系统表面的折射率变化的方法，所述方法包括a)使用固定的酶从酶底物产生不溶性产物，其中所述不溶性产物在LSPR支持表面积聚，以及b)利用LSPR检测由所述不溶性产物的存在引起的表面的反射光或透射光的变化。
2. 如权利要求l所述的方法，其中所述表面包含纳米颗粒，其中 每一 纳米颗粒的大小为约5 nm至约1000 nm。
3. 如权利要求2所述的方法，其中每一纳米颗粒包含选自Au、 Ag、 Ta、 Pt、 Pd、 Rh和Cu的过渡金属。
4. 如权利要求3所述的方法，其中所述过渡金属是金。
5. 如权利要求3所述的方法，其中每一纳米颗粒还包含玻璃或选 自聚苯乙烯、聚曱基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯的聚合物。
6. 如权利要求5所述的方法，其中所述纳米颗粒是具有顶部和底 部的珠，其中所述顶部包被有金属。
7. 如权利要求6所述的方法，其中所述纳米颗粒珠包含聚苯乙烯 且所述金属包含金。
8. 如权利要求l所述的方法，其中所述酶底物是选自氯化硝基蓝 四氮唑(NBT)、 5-溴-4-氯-3'-吲哚基磷酸酯对曱苯胺盐(BCIP)、 3，3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、 4-氯-1 -萘酚(4-CN)和3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐 (DAB)的成员。
9. 如权利要求l所述的方法，其中所述酶是选自^5威性磷酸酶和辣 根过氧化物酶的成员。
10. 如权利要求2所述的方法，其中所述酶通过连接到抗体固定。
11. 如权利要求10所述的方法，其中所述酶通过夹心测定固定。
12. 如权利要求l所述的方法，其中所述检测步骤包括利用LSPR!己的
13. 如权利要求l所述的方法，其中所述检测步骤包括利用LSPR 检测由所述不溶性产物的存在引起的表面透射光的变化。
14. 如权利要求2所述的方法，其中所述LSPR支持表面位于第一 固体支持物上。
15. 如权利要求14所述的方法，其中所述酶固定于所述第一固体 支持物上。
16. 如权利要求14所述的方法，其中所述酶固定于第二固体支持 物上，其中所述第二固体支持物在产生步骤中靠近所述LSPR支持表 面。
17. 如权利要求16所述的方法，其中所述第二固体支持物是透明的。
18. 如权利要求16所述的方法，其中所述第二固体支持物是磁珠。
19. 如权利要求14所述的方法，其中所述第一固体支持物的表面是平滑的。
20. 如权利要求14所述的方法，其中所述第一固体支持物的表面是粗糙的。
21. LSPR传感器，其包含 第一固体支持物；置于所述第一固体支持物上的LSPR支持表面；以及 靠近所述LSPR支持表面的固定的酶。
22. 试剂盒，其包含 权利要求21所述的LSPR传感器；以及 酶底物。
全文摘要
本发明提供了检测局域表面等离子体共振(LSPR)检测系统表面的折射率变化的方法。该方法包括利用固定的酶从酶底物产生不溶性产物，其中所述不溶性产物在LSPR支持表面积聚。所述方法也包括利用LSPR检测由不溶性产物的存在引起的表面反射光或透射光的变化。
文档编号G01N33/551GK101617229SQ200880001661
公开日2009年12月30日 申请日期2008年1月2日 优先权日2007年1月3日
发明者兰迪·斯道尔, 竹井弘之, 达尼埃勒·格利翁 申请人:莱姆达仁公司