用于γ-分泌酶测定的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供基于Notch多肽的多肽底物、基于使用这些底物的测定方法和针对鉴定γ-分泌酶活性抑制剂的筛选方法。所述测定方法和筛选方法适用于高通量多孔板测定仪器。在许多实施方案中，底物多肽被标记以易于检测，和/或可结合其本身被标记的特异性配体。一般来说，所述标记促进检测的高特异性以及高灵敏度。这些特征使得利用标记底物的测定方法和筛选方法尤其适用于高通量测定方式。
【专利说明】用于Gamma-分泌酶测定的方法和组合物
[0001]本申请要求2010年9月7日提交的美国临时申请顺序号61/380，587的权益，其通过引用予以结合。
发明领域
[0002]本发明包括但不限于用于测量伽马-分泌酶(“ Gamma-分泌酶”)活性的组合物和方法及用于鉴定Gamma-分泌酶活性调节剂的测定法。例如，本公开内容描述了新设计的来源于Notch细胞表面受体的底物用于Gamma-分泌酶活性的高灵敏度测定法。此外，本文鉴定的Gamma-分泌酶底物可用于鉴定Gamma-分泌酶活性的调节剂的测定法中。
[0003]发明背景
Gamma-分泌酶加工多种底物，包括淀粉状蛋白前体蛋白(APP)和Notch蛋白。Gamma-分泌酶切割APP释放A β肽，这被广泛认为在阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)中起成因作用。
[0004]Notch信号转导途径是存在大多数多细胞生物中的高度保守的细胞信号转导系统(Artavanis-Tsakonas等，1999, Science 284 (5415): 770-776) 。Notch蛋白家族成员存在于所有后生动物中，哺乳动物具有4个不同的受体，称为NOTCH1、N0TCH2、N0TCH3和N0TCH4。Notch受体是单-通道(single-pass)跨膜受体蛋白质。结合Notch蛋白并启动信号转导的配体与相邻细胞结合。Notch是由大的胞外部分组成的异寡聚体，其在钙依赖性、非共价相互作用中与由短的胞外区、单跨膜通道和小的胞内区组成的Notch蛋白的较小片段缔合(Brou 等，2000，Mol.Cell 5 (2): 207-16)。
[0005]除了作用于APP以外，Gamma-分泌酶还加工Notch和其它I型膜蛋白。Notch还被多种蛋白酶切割。Notch信号转导受配体结合控制，其暴露出易遭受受体的蛋白酶剪切的负控制区。人Notchl cDNA的GenBank登记号为AF308602.1，而对于相应的多肽基因产物，其为AAG33848.1。人Notchl具有2556个氨基酸残基。在加工Notch1时，首先，近膜切割在S2部位(在残基 Alal710 和 Vall711 之间，参见 van Tetering 等，2009，J.Biol.Chem.,284:31018-31027的补充图SlA)通过ADAM (—种解联蛋白和金属蛋白酶)金属蛋白酶进行，除去胞外域以产生锚定膜的Notch胞外截短片段(NEXT)。(ADAM家族包括含有解联蛋白样结构域和金属蛋白酶样结构域的蛋白质。ADAM参与不同的细胞过程例如发育、细胞间相互作用和蛋白质胞外域)。NEXT随后在S3位点(参见van Tetering等，2009，J.Biol.Chem., 284:31018-31027的补充图SlA)被Gamma-分泌酶切割，产生Notch胞内域(NICD)，其易位到核中，在核中其调节在胚胎发生、血细胞生成和干细胞分化期间参与决定细胞命运的靶基因的表达(Chan等，1998，Cell, 94, 423-426 ;Berezovska等，1999，Brain ResMol Brain Res., 69:273-280 和 Redmond 等，2000，Nat.Neurosc1., 3:30-40)。
[0006]Gamma-分泌酶是由至少4个亚基组成的膜结合的天冬氨酰基蛋白酶，4个亚基是早老蛋白(PS，或PS1或PS2)、Aph-1、呆蛋白(Nct)和Pen_2。PS被认为是Gamma-分泌酶的催化亚基，并且PS1和PS2的突变已与家族性阿尔茨海默病(FAD)关联(Sherrington等，1995, Nature, 375:754-760 ；Levy Lahad 等，1995，Science, 269:973-977)。虽然这些 FAD突变的确切病理机制未知，但是已提出假设:它们改变Y -分泌酶的特异性，导致A β 42与Aβ 40 妝的比率提高(Borchelt 等，1996, Neuron, 17:1005-1013 ;Duff 等，1996, Nature,383:710-713 和 Bentahir 等，2006, J Neurochem.，96:732-742)。Αβ 42 比 Αβ 40 更易形成不溶性聚集体，以致FAD突变是有害的。此外，FAD突变还降低Y -分泌酶对Notch和E-钙黏着蛋白加工的活性(Song等，1999，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 96:6959-6963 ；Marambaud 等，2002，EMBO J., 21:1948-1956 和 Marambaud 等，2003，Cell,114:635-645)。若干研究表明，PSl的FAD突变影响Notch切割(Bentahir等，2006，JNeurochem., 96:732-742 ;Song等，1999，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 96:6959-6963;Nakajima等，2000，J Neurosci Res., 62:311-317 ;Amtul 等，2002，Neurobiol Dis.,9:269-273 ;Chen 等，2002，2009，J.Biol.Chem., 277:36521-36526)。
[0007]目前尚不清楚PSl突变对Notchl切割的不同细胞作用是否归因于细胞因素(例如Y-分泌酶复合物的成熟、底物的运输或Y-分泌酶自身的调节)。虽然已报道了使用NlOOFlag底物的无细胞的Notch/Y -分泌酶测定法(Moehlmann等，2002，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 99:8025-8030)，正是基于蛋白质印迹分析的测定法限制了其在Y -分泌酶表征中的应用，因为它是耗费劳力的，具有低通量，而且无法定量。然而，NlOOFlag是否被 Y-分泌酶加工受到质疑(Keller 等，2006，Biochem.,45:5351-5358)。
[0008]发明概述
需要测定PSl突变是否会直接影响Y-分泌酶的催化活性。为了监测对于Notchl切割的Y -分泌酶活性和开发Notch特异性Y -分泌酶抑制剂，需要使用基于Notch蛋白(例如Notchl)的底物的稳固、特异性和灵敏的体外Y-分泌酶测定法。明确需要对Y-分泌酶的轻易蛋白酶解敏感的可靠的基于Notch的底物。需要开发以高灵敏度特异性地测定Notch被Y-分泌酶蛋白酶解的产物的出 现和量的测定法。此外，仍需要开发Y-分泌酶对Notch的实时活性的测定法。此外仍需要可针对其调节PSl对Notch蛋白的活性的能力而筛选候选化合物的有效测定法。本公开内容提供Y-分泌酶催化的Notchl切割的快速简易的体外测定法。检测Y-分泌酶切割的Notchl产物的这种新的体外Y-分泌酶测定法将是用于更好地表征Y-分泌酶和用于鉴定Y-分泌酶对Notch受体家族成员的活性的调节剂的有价值的方法。
[0009]第一方面，本公开内容提供一种试剂，其特异性地结合在S3位点被Y -分泌酶催化的Notch受体蛋白质切割的产物。在许多实施方案中，该试剂不结合未被Y-分泌酶切割的Notch受体蛋白质。在其它实施方案中，该试剂包括抗体。在进一步的实施方案中，抗体是多克隆抗体。在其它实施方案中，抗体是单克隆抗体。在进一步的实施方案中，抗体是单链抗体。在进一步的实施方案中，抗体特异性地结合VLLSRKRRR (SEQ ID N0:2)。在再进一步的实施方案中，通过用包括含有序列VLLSRKRRR (SEQ ID NO:2)的肽的组合物免疫宿主动物来诱发抗体。任选序列VLLSRKRRR (SEQ ID NO: 2)还可在羧基末端包括半胱氨酸残基。
[0010]第二方面，本公开内容提供包括至少部分Notch蛋白的底物肽，其中底物携带第一标记，且其中底物的氨基酸序列可被Y-分泌酶的活性切割以提供可检测的包括第一标记的产物肽。在某些实施方案中，底物肽包括Notch底物，例如但不限于人Notchl蛋白的氨基酸残基1733-1812，其包括可被Y-分泌酶切割的第一易切割的肽键。在许多实施方案中，第一易切割的肽键是S3位点。在一些实施方案中，底物肽还包括与标记的Notch氨基酸序列或其部分连接的标签，其中标签以高亲和力特异性地结合靶标；在许多实施方案中，靶标是含有麦芽糖的多糖。在再进一步的实施方案中，标签通过包括第二易切割的肽键的连接氨基酸序列与底物肽连接，其中连接氨基酸序列构成特定蛋白酶的靶标，蛋白酶的作用导致标签从底物肽中除去。在某些实施方案中，特定蛋白酶是凝血酶。在再进一步的实施方案中，第一标记含有标记性氨基酸序列，其能够起反应以使特定结合对的第一成员与标记性氨基酸序列连接。在另外的实施方案中，特定结合对的第一成员包括生物素。(参见图1A和5A)。
[0011]在具体的实施方案中，底物肽以从N端到C端的顺序包括特异性地结合含有麦芽糖的多糖的标签(例如麦芽糖结合蛋白)、凝血酶靶序列、包括相当于Notchl蛋白的S3位点的第一易切割键的Notchl序列，和可起反应以结合生物素的标记性氨基酸序列；在某些实施方案中，标记包括如此掺入的生物素。在再进一步的具体实施方案中，底物肽以从N端到C端的顺序包括可起反应以结合生物素的标记性氨基酸序列、包括第一易切割键的Notchl序列、凝血酶靶序列和特异性地结合含有麦芽糖的多糖的标签。
[0012]在更进一步的方面，本公开内容提供当掺入合适的宿主细胞中并在适当的培养条件下孵育时，易于表达前两段描述的底物肽的多核苷酸。
[0013]在更进一步的方面，本公开内容包括合成肽底物的方法，其中将前一段落描述的多核苷酸导入合适的宿主细胞中，将宿主细胞在适当的培养条件孵育足以表达肽底物的一段时间，从培养的细胞中分离出肽底物。在又一方面，本公开内容提供包括Y-分泌酶切割位点并在合适条件下被Y-分泌酶切割的多肽。这类多肽包括截短的Notch多肽，其具有比全长的天然Notch细胞表面受体少的氨基酸。这类多肽在本文可称为Notch底物。
[0014]在又一方面，本公开内容提供测定Y-分泌酶的活性的高灵敏度方法，所述方法包括以下步骤:
a)提供疑似含有Y-分泌酶活性的组合物；
b)使组合物与Y-分泌酶的多肽底物接触，所述多肽底物包括与可检测标记结合的至少一部分Notch蛋白，其中通过Y-分泌酶切割标记底物提供可检测标记产物；
c)使标记产物与以下配体接触
1)带有第一标签的第一配体，其中第一配体特异性地结合所述标记，和
2)带有第二标签的第二配体，其中第二配体特异性地结合所述产物；和
d)测定与第一配体和与第二配体结合的标记产物的存在情况和/或量。
[0015]在该方法的某些实施方案中，肽底物包括人Notchl的氨基酸残基1733-1812。在该测定法的其它实施方案中，可检测标记包括生物素。在其它实施方案中，第一配体包括抗生物素蛋白，第一标签含有可检测的第一荧光团，而在进一步的实施方案中，第二配体包括这样的第一抗体，其:a)特异性地结合所述产物的新产生的链末端，和b)与带有第二荧光团的第二抗体结合，使得在第一荧光团和第二荧光团之间发生荧光共振能量转移。在备选实施方案中，第一配体包括抗生物素蛋白和将三线态氧转化成单线态氧的光敏剂，第二配体包括a)特异性地结合产物的新产生的链末端的第一抗体，b)结合第一抗体的第二抗体，和c)由单线态氧依赖性化学发光反应激发的发光发射体。
[0016]在其它方面，本公开内容提供测定Y-分泌酶活性的高通量方法，其包括以下步骤:
a)提供多个容器，每个容器装有疑似含有Y-分泌酶活性的组合物；
b)向每个容器中加入Y-分泌酶的多肽底物，所述多肽底物包括与可检测标记结合的至少一部分Notch蛋白，其中通过Y-分泌酶切割标记底物为每个容器提供可检测标记产物；
c)使标记产物与以下配体接触
1)带有第一标签的第一配体，其中第一配体特异性地结合所述标记，和
2)带有第二标签的第二配体，其中第二配体特异性地结合所述产物；和
d)测定与第一配体和与第二配体结合的标记产物的存在情况和/或量。
[0017]在该方法的不同实施方案中，每个容器是多孔测定板中的孔。在不同的其它实施方案中，板含有至少96孔或至少384孔或至少1536孔。在该方法的某些实施方案中，肽底物包括人Notchl的氨基酸残基1733-1812。在该测定法的其它实施方案中，可检测标记包括生物素。在其它实施方案中，第一配体包括抗生物素蛋白，且第一标签含有可检测的第一荧光团，而在进一步的实施方案中，第二配体包括这样的第一抗体，其:a)特异性地结合所述产物的新产生的链末端，和b)与带有第二荧光团的第二抗体结合，使得在第一荧光团和第二荧光团之间发生荧光共振能量转移。在备选实施方案中，第一配体包括抗生物素蛋白和将三线态氧转化成单线态氧的光敏剂，第二配体包括a)特异性地结合所述产物的新产生的链末端的第一抗体，b)结合第一抗体的第二抗体，和c)由单线态氧依赖性化学发光反应激发的发光发射体。
[0018]在其它方面，公开了测定细胞中的Y-分泌酶活性的方法，其包括以下步骤:
a)提供疑似含有Y-分泌酶活性的细胞；
b)加入含有Y-分泌酶的多肽底物的培养基，所述多肽底物包括与可检测标记结合的至少一部分Notch蛋白，其中通过Y -分泌酶切割标记底物提供标记产物；和
c)测定标记产物的存在情况。
[0019]在某些实施方案中，所述测定包括
c)在适当孵育期后分离细胞以提供上清液；和
d)测定上清液的标记产物。
[0020]在某些实施方案中，测定上清液通过SDS-PAGE进行，随后用特异性地结合产物的新产生的链末端的抗体进行免疫印迹法以鉴定产物的存在情况。在备选实施方案中，所述测定包括固定细胞，并用特异性地结合产物的新产生的链末端的抗体进行完整细胞中产物的免疫组织化学鉴定。在该方法中，培养基还可包括去污剂。另外，在许多实施方案中，所述标记包括生物素。在还有的其它实施方案中，测定标记产物包括测定含有产物和一种或多种可检测探针的可检测复合物，例如包括含有第一可检测探针的第一特异性结合成员的复合物，其中第一特异性结合成员特异性地结合产物以形成二元复合物。在具体的实施方案中，第一探针包括钌，使得检测利用电化学发光法进行。在该测定法的其它实施方案中，还包括
c)在适当孵育期后分离细胞以提供上清液；
d)使标记产物与以下配体接触
I)带有第一标签的第一配体，其中第一配体特异性地结合所述标记，和2)带有第二标签的第二配体，其中第二配体特异性地结合所述产物；和
e)测定与第一配体和与第二配体结合的标记产物的存在情况和/或量。
[0021 ] 在后一实施方案中，第一配体包括抗生物素蛋白，第一标签含有可检测的第一荧光团，而在进一步的实施方案中，第二配体包括这样的第一抗体，其:a)特异性地结合产物的新产生的链末端，和b)与带有第二荧光团的第二抗体结合，使得在第一荧光团和第二荧光团之间发生荧光共振能量转移。在还更进一步的备选实施方案中，第一配体包括抗生物素蛋白和将三线态氧转化成单线态氧的光敏剂，第二配体包括a)特异性地结合产物的新产生的链末端的第一抗体，b)结合第一抗体的第二抗体，和c)由单线态氧依赖性化学发光反应激发的发光发射体。
[0022]在其它方面，本公开内容提供筛选Y-分泌酶活性的调节剂的方法，其包括以下步骤:
a)提供装有包括Y-分泌酶活性的组合物的容器；
b)使组合物与包括候选化合物和Y-分泌酶的多肽底物的混合物接触，所述多肽底物包括与可检测标记结合的至少一部分Notch蛋白，其中通过Y-分泌酶切割标记底物提供可检测标记产物；和
c)测定候选化合物是否调节Y-分泌酶催化切割底物以形成标记产物。
[0023]在该方法的某些实施方案中，肽底物包括人Notchl的氨基酸残基1733-1812。在该方法的许多实施方案中，所述标记包括生物素。在其它实施方案中，测定标记产物的形成包括测定包括产物和一种或多种可检测探针的可检测复合物。在某些实施方案中，复合物含有包括第一可检测探针的第一特异性结合成员，其中第一特异性结合成员特异性地结合产物以形成二元复合物，而在某些实施方案中`，第一探针包括钌，使得检测利用电化学发光法进行。
[0024]在该方法的其它实施方案中，所述测定还包括
d)使标记产物与以下配体接触
1)带有第一标签的第一配体，其中第一配体特异性地结合标记，和
2)带有第二标签的第二配体，其中第二配体特异性地结合产物；和
e)测定与第一配体和与第二配体结合的标记产物的存在情况和/或量。
[0025]在这种变化的某些实施方案中，第一配体包括抗生物素蛋白，第一标签含有可检测的第一荧光团，而在进一步的实施方案中，第二配体包括这样的第一抗体，其:a)特异性地结合产物的新产生的链末端，和b)与带有第二荧光团的第二抗体结合，使得在第一荧光团和第二荧光团之间发生荧光共振能量转移。在备选实施方案中，第一配体包括抗生物素蛋白和将三线态氧转化成单线态氧的光敏剂，第二配体包括a)特异性地结合产物的新产生的链末端的第一抗体，b)结合第一抗体的第二抗体，和c)由单线态氧依赖性化学发光反应激发的发光发射体。
[0026]在其它方面，本公开内容提供筛选Y-分泌酶活性的调节剂的高通量方法，其包括以下步骤:
a)提供多个容器，每个容器装有含有Y-分泌酶活性的组合物；
b)向每个容器中加入包括候选化合物和Y-分泌酶的多肽底物的组合物，所述多肽底物包括与可检测标记结合的至少一部分Notch蛋白，其中通过Y-分泌酶切割标记底物提供以闻灵敏度可检测的标记广物；和
C)测定候选化合物是否调节Y-分泌酶催化切割底物以形成标记产物。
[0027]在该筛选方法的不同实施方案中，每个容器是多孔测定板中的孔；而在筛选的具体实施方案中，板含有至少96孔或至少384孔或至少1536孔。
[0028]在该方法的某些实施方案中，肽底物包括人Notchl的氨基酸残基1733-1812。在该方法的许多实施方案中，所述标记包括生物素。在其它实施方案中，测定标记产物的形成包括测定包括产物和一种或多种可检测探针的可检测复合物。在某些实施方案中，复合物含有包括第一可检测探针的第一特异性结合成员，其中第一特异性结合成员特异性地结合产物以形成二元复合物，而在某些实施方案中，第一探针包括钌，使得检测利用电化学发光法进行。
[0029]在高通量筛选方法的其它实施方案中，所述测定还包括
c)使标记产物与以下配体接触
1)带有第一标签的第一配体，其中第一配体特异性地结合所述标记，和
2)带有第二标签的第二配体，其中第二配体特异性地结合所述产物；和
d)测定候选化合物是否调节与第一配体和与第二配体结合的标记产物的存在情况和
/或量° [0030]在这种变化的某些实施方案中，第一配体包括抗生物素蛋白，第一标签含有可检测的第一荧光团，而在进一步的实施方案中，第二配体包括这样的第一抗体，其:a)特异性地结合产物的新产生的链末端，和b)与带有第二荧光团的第二抗体结合，使得在第一荧光团和第二荧光团之间发生荧光共振能量转移。在备选实施方案中，第一配体包括抗生物素蛋白和将三线态氧转化成单线态氧的光敏剂，第二配体包括a)特异性地结合产物的新产生的链末端的第一抗体，b)结合第一抗体的第二抗体，和c)由单线态氧依赖性化学发光反应激发的发光发射体。
[0031]在还更进一步的方面，本公开内容提供的是筛选细胞的Y-分泌酶活性的调节剂的方法，其包括以下步骤:
a)提供装有含有Y-分泌酶活性的细胞的容器；
b)向容器中加入含有候选化合物和Y-分泌酶的多肽底物的培养基，所述多肽底物包括与可检测标记结合的至少一部分Notch蛋白，其中通过Y -分泌酶切割标记底物提供以闻灵敏度可检测的标记广物；和
c)测定候选化合物是否调节标记产物的形成。
[0032]在某些实施方案中，所述测定包括
c)在适当孵育期后分离细胞以提供上清液；和
d)测定上清液以测定候选化合物是否调节标记产物的形成。
[0033]在某些实施方案中，测定上清液通过SDS-PAGE进行，随后用特异性地结合产物的新产生的链末端的抗体进行免疫印迹法以鉴定产物的存在情况。在备选实施方案中，测定包括固定细胞，并用特异性地结合产物的新产生的链末端的抗体进行完整细胞中产物的免疫组织化学鉴定。在该方法中，培养基还可包括去污剂。在该方法的某些实施方案中，肽底物包括人Notchl的氨基酸残基1733-1812。另外，在许多实施方案中，所述标记包括生物素。在还有的其它实施方案中，测定标记产物包括测定含有产物和一种或多种可检测探针的可检测复合物，例如包括含有第一可检测探针的第一特异性结合成员的复合物，其中第一特异性结合成员特异性地结合产物以形成二元复合物。在具体的实施方案中，第一探针包括钌，使得检测利用电化学发光法进行。在该测定法的其它实施方案中，还包括
c)在适当孵育期后分离细胞以提供上清液；
d)使标记产物与以下配体接触
1)带有第一标签的第一配体，其中第一配体特异性地结合所述标记，和
2)带有第二标签的第二配体，其中第二配体特异性地结合所述产物；和
e)测定候选化合物是否调节与第一配体和与第二配体结合的标记产物的存在情况和
/或量°
[0034]在后一实施方案中，第一配体包括抗生物素蛋白，第一标签含有可检测的第一荧光团，而在进一步的实施方案中，第二配体包括这样的第一抗体，其:a)特异性地结合产物的新产生的链末端，和b)与带有第二荧光团的第二抗体结合，使得在第一荧光团和第二荧光团之间发生荧光共振能量转移。在还更进一步的备选实施方案中，第一配体包括抗生物素蛋白和将三线态氧转化成单线态氧的光敏剂，第二配体包括a)特异性地结合产物的新产生的链末端的第一抗体，b)结合第一抗体的第二抗体，和c)由单线态氧依赖性化学发光反应激发的发光发射体。
[0035]在还有的其它方面，本公开内容提供筛选细胞的Y-分泌酶活性的调节剂的高通量方法，所述方法包括以下步骤:
a)提供多个容器，每个容器装有含有Y-分泌酶活性的细胞；` b)向每个容器中加入包括候选化合物和Y-分泌酶的多肽底物的培养基，所述多肽底物包括与可检测标记结合的至少一部分Notch蛋白，其中通过Y -分泌酶切割标记底物提供以闻灵敏度可检测的标记广物；和
c)在每个容器中测定候选化合物是否调节Y-分泌酶催化切割底物以形成标记产物。
[0036]在该筛选方法的不同实施方案中，每个容器是多孔测定板中的孔；在某些实施方案中板含有至少96孔或至少384孔或至少1536孔。
[0037]附图简述
图1.使用质粒pIAD16-MBP-Nl-Avi产生生物素化重组Nl-Sbl底物。A)蛋白质表达和纯化的图示。B)产物的考马斯染色。C)纯化产物的LC-MS分析。
[0038]图2.具有Nl-Sbl插入序列的pIAD16的质粒图。
[0039]图3.MBP-Nl-Sbl融合物的核苷酸序列(SEQ ID NO:4) ?
[0040]图4.具有Nl-Sbl插入序列的pIAD16的质粒序列(SEQ ID NO:5)。
[0041]图5.体外Nl-Sbl Y _分泌酶测定法。A.体外Y _分泌酶测定法和采用扩增发光近距离均相测定法(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)检测的图示。B.L685458和化合物E对Y -分泌酶活性的抑制效能。C.使用Nl-Sbl底物的Y -分泌酶的动力学分析。
[0042]图6.蛋白质印迹分析中SM320抗体特异性地识别Y -分泌酶切割的Notch产物(A)和免疫染色(B)。在Y-分泌酶抑制剂(L-685, 458)不存在或存在下，将Δ E-Notchl(胞外部分缺失的Notch构建体)或对照载体转染至HEK293细胞中。用抗MYC和SM320抗体通过蛋白质印迹分析细胞裂解物㈧。将ΛE-Notchl转染的细胞固定、透化并用DAPI (可见深蓝色形状)、抗Myc/抗小鼠-Alexa-fluor 594 (红色)和SM321/抗兔-Alexa-fluor488 (绿色)染色。B.4区.在L-685458不存在时的合并图像(1-3区)。在深蓝色形状的背景下，在中部观察到浅黄色至黄橙色斑点。5区.在L-685458存在时的SM320染色。未观察到任何颜色的斑点。6区.L-685，458处理细胞的合并图像。(未检测到绿色。在模糊的深蓝色形状的背景下，可见到散布有黑色的深红色斑块)。
[0043]图7.各种PSl物类的Y-分泌酶活性。A) Nl-Sbl底物。B) Sb4底物。C) Nl-Sbl底物。D) Sb4底物。
[0044]图8.各种PSl物类的Y -分泌酶活性。A)随底物浓度而变化的各种PSl物类的信号强度。B)随底物浓度而变化的膜级分中的各种PSl物类的信号强度。C) Y-分泌酶被化合物E抑制。D) Y -分泌酶活性被L-685，458抑制。
[0045]图9.ALPHA测定法中所观察到的Y -分泌酶活性对不同实验参数的依赖。A)对SM320抗体浓度的依赖。B)对链霉抗生物素供体珠浓度的依赖。C)对A蛋白接纳珠浓度的依赖。D)应用于384和1536孔板的优化条件。
[0046]图10.PSl突变改变Y-分泌酶的S2亚口袋(subpocket)构象。(a) L458侧链残基(P/P’位置)与相应的Y-分泌酶亚位点(S/S’)间的相互作用的图示。(b) JC8、GY4和L646的结构，其中二苯甲酮分别掺入L458的P1’、P1或P2部位。使生物素与探针连接以利于光标记蛋白(photolabeled protein)的分离。(c)具有JC8、GY4和L646的PSl NTF的光标记。将自WT、M146L或E280A PSl稳定细胞系分离的膜用于该研究。(d)通过将GY4和L646的标记强度与JC8的标记强度进行比较，来量化光标记的PSl NTF0 (e)自M146V分离的Y-分泌酶或来自敲入小鼠脑的WT PSl的分析。使用抗PSl NTF抗体，用蛋白质印迹分析检测光标记的PSl。(f)光标记的PSl NTF的分析通过比较L646与JC8的标记强度来量化。`
`[0047]图11.PSl突变体更喜欢具有较大P2残基的Nl-Sbl底物。(a)具有野生型P2残基半胱氨酸的Nl-Sbl的图示。(b)显示了被丙氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸取代的野生型半胱氨酸残基的相对大小差异。(c)得自稳定细胞系的M146L、E280A和WT PSl用来确定或MNl-Sbl的催化。(d)比较WT和M146V PSl间的C和M Nl-Sbl的催化。(n=3，平均值+/-标准差 ***ρ〈0.001, **ρ〈0.01) ο
[0048]图12.APP的WT PSl和FAD PSl切割的图示。(a) Y -分泌酶在几个位置处切割APP，例如用于Αβ40和Αβ42产生的Y位点，以及产生Αβ 48和Αβ 49肽的ε位点。顺序切割模型提出，￥-分泌酶先在八0 49位点切割4--，接着是40 4640 43和40 40 (绿色虚线)，或Y -分泌酶可在A β 48位点切割ΑΡΡ，接着是A β 45和A β 42 (红色虚线)。(b)在A β 40、A β 42/48或A β 49切割期间Ρ2残基相对大小的比较。因为A β 42/40和A β 48/49比率的增加与FAD PSl有关，这就表明较深的FAD PSl的S2亚口袋更喜欢具有较大Ρ2残基(Ile)的Αβ 42和Αβ 48切割，而具有较浅的S2亚位点的WT PSl更喜欢具有较小Ρ2残基(例如Val和Thr)的A β 40和A β 49切割。
[0049]发明详述
本文所用术语“Notch蛋白”及相关术语和表述一般涉及存在于后生动物中的细胞表面受体的Notch家族的任何成员。哺乳动物具有4个不同的Notch受体，称为N0TCH1、N0TCH2、N0TCH3和N0TCH4。人Notchl氨基酸序列的实例公开于GenBank登记号AAG33848.1(G1:11275980)，并且复制于下表1中。
[0050]表1 (SEQ ID NO:1) ?
【权利要求】
1.一种测定Y-分泌酶的活性的方法，所述方法包括: 提供疑似含有Y-分泌酶活性的组合物； 使所述组合物与Y -分泌酶的多肽底物接触，所述多肽底物包含与可检测标记结合的Notch底物，其中所述Notch底物被Y -分泌酶切割提供可检测标记产物； 使所述可检测标记产物与以下配体接触: 包含第一标签的第一配体，其中所述第一配体特异性地结合可检测标记，和 包含第一标签的第二配体，其中所述第一配体特异性地结合可检测标记产物；和 测定与所述第一配体和与所述第二配体结合的可检测标记产物的存在情况、量或其组口 ο
2.权利要求1的方法，其中所述Notch底物包含与SEQID NO: 7具有至少90%同一性的氨基酸序列。
3.权利要求1的方法，其中所述接触发生在容器中。
4.权利要求3的方法，其中所述方法是在多个容器中进行的高通量测定方法。
5.权利要求4的方法，其中每个容器是多孔测定板中的孔，从而提供高通量的测定方法。
6.权利要求1的方法，其中所述可检测标记包含生物素。
7.权利要求1的方法，其中所述第一配体包含抗生物素蛋白，所述第一标签包含可检测荧光接纳体。
8.权利要求7的方法，其中所述第二配体包含特异性地结合被Y-分泌酶切割后的Notch底物而不特异性地结合被Y -分泌酶切割前的Notch底物的第一抗体，所述第一抗体与带有荧光供体的第二抗体结合，所述荧光供体激发与所述第一配体结合的荧光接纳体标签。
9.一种测定细胞中Y-分泌酶的活性的方法，所述方法包括: 提供疑似带有Y-分泌酶活性的细胞； 使细胞与包含Y -分泌酶的多肽底物的培养基接触，其中所述底物包含与可检测标记结合的Notch底物，其中通过Y -分泌酶切割标记底物提供可检测标记产物；和测定所述可检测标记产物的存在情况。
10.权利要求9的方法，其中所述测定包括: 在合适的孵育期后从培养基中分离细胞以提供上清液；和 测定所述上清液的标记产物。
11.权利要求10的方法，其中所述测定还包括: 使所述可检测标记产物与以下配体接触: 包含第一标签的第一配体，其中所述第一配体特异性地结合可检测标记，和 包含第二标签的第二配体，其中所述第二配体特异性地结合可检测标记产物；和 测定与所述第一配体和与所述第二配体结合的标记产物的存在情况、量或其组合。
12.权利要求9的方法，其中所述培养基还包含去污剂。
13.权利要求9的方法，其中所述可检测标记包含生物素。
14.权利要求10的方法，其中测定所述可检测标记产物包括测定包含可检测标记产物和可检测探针的可检测复合物。
15.权利要求14的方法，其中所述复合物包含含有第一可检测探针的第一特异性结合成员，其中所述第一特异性结合成员特异性地结合所述可检测标记产物以形成二元复合物。
16.权利要求15的方法，其中所述第一探针包含钌。
17.权利要求9的方法，其中所述Notch底物包含与SEQID NO: 7具有至少90%同一性的氨基酸序列。
18.权利要求9的方法，其中所述接触发生在容器中。
19.权利要求18的方法，其中所述方法是在多个容器中进行的高通量测定方法。
20.权利要求19的方法，其中每个容器是多孔测定板中的孔，从而提供高通量的测定方法。
21.权利要求11的方法，其中所述第一配体包含抗生物素蛋白，所述第一标签包含可检测荧光接纳体。
22.权利要求21的方法，其中所述第二配体包含特异性地结合被Y-分泌酶切割后的Notch底物而不特异性地结合被Y -分泌酶切割前的Notch底物的第一抗体，所述第一抗体与带有荧光供体的第二抗体结合，所述荧光供体激发与所述第一配体结合的荧光接纳体标签。
23.—种筛选Y-分泌酶活性的调节剂的方法，所述方法包括: 提供包含Y-分泌酶活性的组合物； 使所述组合物与包含候选化合`物和Y-分泌酶的多肽底物的混合物接触，其中所述底物包含与可检测标记结合的Notch底物，其中通过Y -分泌酶切割标记底物提供可检测标记产物；和 测定所述候选化合物是否调节所述可检测标记产物的形成。
24.权利要求23的方法，其中所述Notch底物包含与SEQID NO: 7具有至少90%同一性的氨基酸序列。
25.权利要求23的方法，其中所述接触发生在容器中。
26.权利要求25的方法，其中所述方法是在多个容器中进行的高通量测定方法。
27.权利要求26的方法，其中每个容器是多孔测定板中的孔，从而提供高通量的测定方法。
28.权利要求23的方法，其中所述可检测标记包含生物素。
29.权利要求23的方法，其中测定所述可检测标记产物包括测定包含产物和可检测探针的可检测复合物。
30.权利要求29的方法，其中所述复合物包含含有第一可检测探针的第一特异性结合成员，其中所述第一特异性结合成员特异性地结合所述产物以形成二元复合物。
31.权利要求30描述的方法，其中所述第一探针包含钌。
32.权利要求23描述的方法，其中所述测定还包括 使所述可检测标记产物与以下配体接触: 包含第一标签的第一配体，其中所述第一配体特异性地结合标记，和 包含第二标签的第二配体，其中所述第二配体特异性地结合产物；和 测定与所述第一配体和与所述第二配体结合的标记产物的存在情况、量或其组合。
33.权利要求32的方法，其中所述第一配体包含抗生物素蛋白，所述第一标签包含可检测荧光接纳体。
34.权利要求32的方法，其中所述第二配体包含特异性地结合被Y-分泌酶切割后的Notch底物而不特异性地结合被Y -分泌酶切割前的Notch底物的第一抗体，所述第一抗体与带有荧光供体的第二抗体结合，所述荧光供体激发与所述第一配体结合的荧光接纳体标签。
35.一种筛选细胞的Y-分泌酶活性的调节剂的方法，所述方法包括: 提供包含Y-分泌酶活性的细胞； 使所述细胞与包含候选化合物和Y -分泌酶的多肽底物的培养基接触，其中所述底物包含与可检测标记结合的Notch底物，其中所述Notch底物被Y -分泌酶切割提供可检测标记产物；和 测定所述候选化合物是否调节所述可检测标记产物的形成。
36.权利要求35的方法，其中所述测定包括 在适当孵育期后分离细胞以提供上清液；和 测定所述上清液以测定所述候选化合物是否调节所述标记产物的形成。
37.权利要求36的方法，其中所述测定还包括 使所述可检测标记产物与以下配体接触: 带有第一标签的第一配体，其中所述第一配体特异性地结合标记，和 带有第二标签的第二配体，其中所述第二配体特异性地结合产物；和 测定所述候选化合物是否调节与所述第一配体和与所述第二配体结合的标记产物的存在情况和/或量。
38.权利要求35的方法，其中所述培养基还包含去污剂。
39.权利要求35的方法，其中所述可检测标记包含生物素。
40.权利要求36的方法，其中测定所述可检测标记产物包括测定包含可检测标记产物和可检测探针的可检测复合物。
41.权利要求40的方法，其中所述复合物包含含有第一可检测探针的第一特异性结合成员，其中所述第一特异性结合成员特异性地结合所述可检测标记产物以形成二元复合物。
42.权利要求41的方法，其中所述第一探针包含钌。
43.权利要求35的方法，其中所述Notch底物包含与SEQID NO: 7具有至少90%同一性的氨基酸序列。
44.权利要求35的方法，其中所述接触发生在容器中。
45.权利要求44的方法，其中所述方法是在多个容器中进行的高通量测定方法。
46.权利要求45的方法，其中每个容器是多孔测定板中的孔，从而提供高通量的测定方法。
47.权利要求11的方法，其中所述第一配体包含抗生物素蛋白，所述第一标签包含可检测荧光接纳体。
48.权利要求37的方法，其中所述第二配体包含特异性地结合被Y-分泌酶切割后的Notch底物而不特异性地结合被Y -分泌酶切割前的Notch底物的第一抗体，所述第一抗体与带有荧光供体的第二抗体结合，所述荧光供体激发与所述第一配体结合的荧光接纳体标签。
49.一种试剂，其特异性地结合Notch底物在S3位点处的切割产物，所述切割在合适条件下被Y-分泌酶催化。
50.权利要求49的试剂，其中所述试剂包含抗体。
51.权利要求50的试剂，其中所述抗体特异性地结合VLLSRKRRR。
52.权利要求51的试剂，其中所述抗体通过用包含含有序列VLLSRKRRR的肽的组合物免疫宿主动物而获得。
53.一种包含Notch底物的多肽底物，其中所述多肽底物包含第一标记，且其中所述Notch底物的氨基酸序列可在合适条件被Y -分泌酶的活性切割以提供包含第一标记的可检测产物肽。
54.权利要求53的多肽底物，其中所述多肽底物还包含与Notch底物连接的标签。
55.权利要求53的多肽底物，其中所述第一标记包含标记性氨基酸序列，其可起反应以使特定结合对的第一成员与所述`标记性氨基酸序列连接。
【文档编号】G01N33/68GK103502466SQ201180053657
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2011年9月7日 优先权日:2010年9月7日
【发明者】李月明, 周德明, 詹尼弗·钱, 克里斯蒂娜·克伦普 申请人:斯隆－凯特林纪念癌症中心