一种制备固定化耐热过氧化氢酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域，涉及制备固定化耐热过氧化氢酶的方法，特别是涉及 在高温条件下制备固定化耐热过氧化氢酶的方法。
【背景技术】
[0002] 过氧化氢酶（CAT)又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。它是一类抗氧化剂， 以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气这两种无害 物质。正是由于这一高效环保的功效，过氧化氢酶被广泛应用于食品，医药，环保和水处理 等领域（Zhang D.X.，et al·，Chinese journal of biotechnology, 2012, 26:1473-1481; Wang L.，et a I.，Electroana lysis, 2004, 16:627-632.)。固定化酶技术是产生于 20 世 纪六十年代，目前已广泛应用于生物催化领域的工业生产中。与游离酶相比，固定化酶具 有稳定性高、回收方便、易于控制、可重复使用、成本低廉等优点，因此工业应用中生产生 物催化剂酶的固定化已经成为人们研宄的热点（Sheldon R.A.，et al, Chemical society reviews, 2013, 42:6223-6235)。
[0003] 而在固定化酶的工业应用中，为了降低固定化酶的使用成本，一般要求固定化酶 具有较好的活性和稳定性，可以重复、多批次的使用（Liese A.，et al, Chemical society reviews, 2013, 42, 6236-6249)。因此，在过氧化氢酶工业化应用的开发中，可以通过酶分子 的基因工程改造、新型固定化酶载体的制备、固定化工艺的改进等，制备得到酶活高、稳定 性好的固定化过氧化氢酶。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种制备固定化耐热过氧化氢酶的方法，该方法在基本不影响耐热 过氧化氢酶活性的前提下，进一步提高了固定化酶的催化稳定性并缩短了固定化时间，因 此该方法降低了固定化成本并更有利于固定化酶的工业生产。
[0005] 发明人发现在高温条件下进行耐热过氧化氢酶的固定化，可以大大缩短固定化时 间和降低所需的缓冲液浓度，且获得的固定化耐热过氧化氢酶的热稳定性显著增加。另外， 发明人还发现在高温固定化之前预先对耐热过氧化氢酶进行高温纯化，可以获得更好的效 果。
[0006] 用于本发明的方法在载体可以是酶固定化领域常用载体，例如氨基载体和环氧基 载体，但是优选环氧基载体。
[0007] 一种制备固定化耐热过氧化氢酶的方法，其特征在于在45-70°C下，优选50-65°C 下，将游离耐热过氧化氢酶与载体在缓冲液中混合，获得的固定化耐热过氧化氢酶，混合的 时间为〇. 5-10小时，优选1. 5小时。
[0008] 所述混合在缓冲液中进行。所述缓冲液为磷酸缓冲液或硼酸缓冲液。所述缓冲液 的使用浓度为〇· 1-1. 2mol/L，优选0· 8mol/L〇
[0009] 所述混合在搅拌下进行，所述搅拌的速度为50-300rpm，优选150rpm。
[0010] 在所述混合之前通过将游离耐热过氧化氢酶放置在50-70 °C下，优选65 °C下，对 其进行纯化。所述纯化的时间为0. 5-10h，优选1. 5小时。
[0011] 所述载体包括氨基载体和环氧基载体，优选环氧基载体。
[0012] 本发明具有以下优点：
[0013] (1)在高温条件下对耐热过氧化氢酶进行纯化，操作简单易行，纯化效果较好。
[0014] (2)高温制备的固定化过氧化氢酶较常温制备的固定化过氧化氢酶热稳定性增 强。
[0015] (3)固定化所需的时间大大缩短，且固定化时需加入的缓冲液浓度大大降低。
[0016] (4)所用的试剂都是常见的试剂，用量较小，成本低，无污染。
[0017] (5)本方法具有工艺简单、操作方便、操作稳定性好等特点，非常适于工业化生产。
【具体实施方式】
[0018] 如果没有特别说明，在本申请中所述的过氧化氢酶就是指耐热过氧化氢酶。
[0019] 作为本发明的方法中使用的耐热过氧化氢酶，其可以通过本领域技术人员已知的 方法获得。举例来说，所述过氧化氢酶可以通过微生物如重组大肠杆菌培养获得；例如，由 重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET28-CATHis经过摇瓶培养，超声波细胞破碎，离心，制备而得 (Luo H, et a I. , Advances in Materials Research, 2012, 365:367-374)〇
[0020] 作为本发明的方法中使用的载体，为酶固定化工艺中常用的富含环氧基的载体， 也称为环氧基载体，以及富含氨基的载体，即氨基载体。本发明所采用的环氧基载体和氨基 载体（例如LX1000-EPC和LX1000-HA)得自西安蓝晓科技有限公司。
[0021] 作为在本发明的方法中使用的缓冲体系可以为磷酸缓冲液、硼酸缓冲液等。
[0022] 以下通过具体实施例，对高温制备固定化过氧化氢酶的方法进行详细的阐述。
[0023] 实施例中的分析方法：
[0024] (1)游离过氧化氢酶的酶活测定：
[0025] 过氧化氢酶活力的定义：在25°C、pH7.0、底物浓度一定的条件下，每分钟分解 1 μ mol过氧化氢所需的酶量为1个活力单位。
[0026] 1)用0· lmol/L、pH7. 0的磷酸钾缓冲液配制6, 12, 18, 24, 30mM的过氧化氢溶液。
[0027] 2)取ImL上述方法配制的过氧化氢底物溶液和2mL磷酸缓冲液（pH7. 0)加入Icm 比色皿中混匀
[0028] 3)以去离子水为空白对照，在240nm波长处测量其吸光度值（采用上海尤尼柯仪 器有限公司生产的UV-3802准双光束紫外可见分光光度计进行测定）。以过氧化氢浓度为 横坐标，OD 24tl为纵坐标绘制标准曲线。
[0029] 4)用0· lmol/L、pH7. 0的磷酸钾缓冲液配制30mM的过氧化氢溶液。
[0030] 5)取lmL，30mM过氧化氢底物溶液和I. 9mL磷酸缓冲液（pH7. 0)加入Icm比色皿 中，最后加入0.1 mL酶液混勾
[0031] 6)以去离子水为空白对照，在240nm波长处测量其吸光度值，每隔半分钟记一次 数，连续5min内计数。
[0032] 7)通过标准曲线和以下公式，计算出游离过氧化氢酶的活性： p AOD*V
[0033] E = ^-- ε24ι, +T个 v
[0034] 其中，AOD--取5min内体系内在240nm下，吸光度值的变化线性部分
[0035] V 体系体积/mL
[0036] ε 24〇--240nm下过氧化氢的摩尔消光系数（0. 0408)
[0037] T一一催化体系线性反应时间/min
[0038] V--酶液体积/mL
[0039] (2)固定化过氧化氢酶的酶活测定：
[0040] 1)称取约0· Ig的固定化酶于25°C预热5min。
[0041] 2)加入25°C预热的0. lmol/L、pH7. 0的磷酸钾缓冲液配制70mM的过氧化氢溶液 5mL〇
[0042] 3) 25°C、160rpm 反应 lmin。
[0043] 4)取ImL上清液加入硫酸进行终止反应。
[0044] 5)将上述混合液12000rpm离心3min后取ImL上清液到Icm比色皿中，再加入2mL 的0. lmol/L、pH7. 0的磷酸钾缓冲液测定其在240nm处的吸光度值（采用上海尤尼柯仪器 有限公司生产的UV-3802准双光束紫外可见分光光度计进行测定）。
[0045] 6)通过标准曲线计算过氧化氢反应前后的浓度，固定化过氧化氢酶的活性计算公 式如下：
[0046]
【主权项】
1. 一种制备固定化耐热过氧化氢酶的方法，其特征在于在45-70°C下，将游离耐热过 氧化氢酶与载体在缓冲液中混合，混合的时间为0. 5-10小时，获得的固定化耐热过氧化氢 酶。
2. 权利要求1所述的制备固定化耐热过氧化氢酶方法，其特征在于所述载体为氨基载 体或环氧基载体。
3. 权利要求1所述的制备固定化耐热过氧化氢酶方法，其特征在于其中所述混合温度 是 50-65 °C。
4. 权利要求1所述的制备固定化耐热过氧化氢酶方法，其特征在于混合的时间为1. 5 小时。
5. 权利要求1所述的制备固定化耐热过氧化氢酶方法，其特征在于所述缓冲液为磷酸 缓冲液或硼酸缓冲液，缓冲液的使用浓度为〇. 1-1. 2mol/L。
6. 权利要求5所述的制备固定化耐热过氧化氢酶方法，其特征在于缓冲液的使用浓度 为 0? 8mol/L。
7. 权利要求1或3或4任一项所述的制备固定化耐热过氧化氢酶方法，其特征在于所 述混合在搅拌下进行，搅拌的速度为50-300rpm。
8. 权利要求7所述的制备固定化耐热过氧化氢酶方法，其特征在于所述混合搅拌的速 度为 150rpm。
9. 权利要求1所述的制备固定化耐热过氧化氢酶的方法，其特征在于在所述混合之前 要将游离耐热过氧化氢酶放置在50-70°C下进行纯化，纯化的时间为0. 5-10h。
10. 权利要求9所述的制备固定化耐热过氧化氢酶的方法，其特征在于游离耐热过氧 化氢酶的纯化温度为65°C，纯化时间为1. 5小时。
【专利摘要】本发明公开了一种制备固定化耐热过氧化氢酶的方法，属于生物化学领域。所述方法包括：在45-70℃下，优选50-65℃下，将游离耐热过氧化氢酶与载体在缓冲液中混合，获得的固定化耐热过氧化氢酶。本发明方法能够获得具有较高稳定性的固定化过氧化氢酶，本发明提供的制备方法具有操作简单、工艺稳定、耗时短、生产成本低等优点。
【IPC分类】C12N9-08, C12N11-00
【公开号】CN104726442
【申请号】CN201510104705
【发明人】常雁红, 罗晖, 徐娟
【申请人】北京科技大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月10日