专利名称：一种检测食品中残留过氧化氢的酶-比色法的制作方法
技术领域：
本发明涉及食品安全检测中过氧化氢的检測，尤其是采用酶-比色法对食品中残留过氧化氢的測定。
背景技术：
过氧化氢俗称双氧水，无色、无味，有氧化性、除臭、脱色和杀菌等作用。同时，双氧水在无菌食品包装杀菌エ序是常用的杀菌剂，如乳品生产中利乐包装设备必须使用过氧化氢杀菌剂。然而由于双氧水的特殊性质，不法人员将其加到食品中使卖相变得更好或保质期更长，过去在牛奶、豆腐干、水产品、水发产品、肉制品等食品中都有检出。在牛奶生产过程中有人滥用エ业过氧化氢来抑制细菌的繁殖，降低亚硝酸盐的含量。但高浓度的过氧化氢不仅会影响食品的品质，也会严重损害消费者的健康。在GB2760-2007《食品添加剂使用卫生标准》中，过氧化氢已从食品添加剂中删除，被列入了“食品エ业用加工助剂使用名単”，在食品生产加工作为助剂可以使用。根据《食品安全法》规定，食品中的过氧化氢残留不得检出。因此研究一种有效、快速、特异性强、检测限低的方法是十分必要的。食品中残留过氧化氢的检测方法主要有滴定分析(高锰酸钾法或碘量法)、分光光度法、荧光法、高效液相色谱法。我国检测食品中残留过氧化氢的方法为国家标准GB/T23499-2009《食品中残留过氧化氢的測定方法》，该标准中采用的是碘量法和钛盐比色法。而液相色谱法需要较昂贵的仪器，且样品前处理也比较复杂，检测时间长。市场上同时也有快速检测过氧化氢的试纸和检测仪，如双氧水试纸条，基于传感器和电分析的便携式过氧化氢检测仪等。根据过氧化氢的特性，研制出来的常见快速方法有试纸法，如柴春彦等利用光典型生物传感器制成的过氧化物酶测试条(CN200710047154，检测食品中过氧化氢快速测试条)；谢莉等研制的过氧化物酶催化四甲基联苯胺显色的试纸条(牛奶中过氧化氢快速检测试纸条的研制，食品科技，2012，37 (3)，301-303);王炜军等公开了ー种利用过氧化物酶和显色剂反应来测定过氧化氢浓度的酶试纸(CN100516843C —种用于测定过氧化氢浓度的酶试纸)。本发明建立了一种检测食品中残留过氧化氢的酶-比色法，该方法简单、快速、准确、有效、成本低，能实现大批样品的快速定性定量检测，检出限低。
发明内容
本发明的目的是提供ー种测定食品中残留过氧化氢的方法。为此，本发明采用的技术方案是:(I)将固体样品粉碎均匀，取样5-10g(精确至0.0Olg)，对液体样品混匀后量取10-20mL于50mL容量瓶中。依次加5mL硫酸锌溶液，5mL亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白和脂肪，混勻，加水定容至刻度。放置10-20min。用滤纸或0.45 y m滤膜过滤。如果沉淀蛋白和脂肪后的样品溶液含有顔色，可加入Ig活性炭振摇lmin，滤纸过滤，或将样品溶液通过活性炭固相萃取小柱，除色，收集净化液，待用。如果经过活性炭吸附试样液仍然有颜色干扰，测定时应扣除试样液的本底色。(2)滤液用稀酸和稀碱调节溶液pH值在7.6,混匀后用滤纸或0.45 iim滤膜过滤。(3)取10-20mL滤液于25或50mL容量瓶中，加入过氧化物酶试剂溶液l-3mL，30-40°C水浴恒温显色10-20min，冷却至室温，定容至刻度。(4)采用分光光度法进行检测，在470nm波长处测定吸光度。吸光度与过氧化氢的含量成正比，从而计算样品中过氧化氢的含量。步骤(I)中所用的硫酸锌溶液配制:称取53.5g七水硫酸锌溶于水中，并稀释定容至 IOOmL。步骤(I)中所用的亚铁氰化钾溶液配制:称取17.2g三水亚铁氰化钾溶于水中，并稀释定容至100mL。步骤⑵中所用的稀酸，为稀盐酸或稀硫酸溶液，质量浓度0.01-1.0%。步骤(2)中所用的稀碱，为稀氢氧化钠或氢氧化钾溶液，质量浓度为0.01-1.0%。步骤(3)所用的过氧化物酶试剂溶液由辣根过氧化物酶、邻甲氧基苯酚的磷酸盐缓冲液显色剂组成。含邻甲氧基苯酚0.0050mol/L的0.2mol/L的磷酸盐缓冲液(pH= 7.6)。使用时将辣根过氧化物酶固体粉末加入到混合溶液中，轻轻混匀，配制成酶活力5U (活力単位)/mL，4°C下可以保存I个月。步骤⑶中所用的水浴温度，优选37°C。如果样品中含有过氧化氢，则溶液变粉红色或红褐色，显色明显。本方法的创新性在于经过氧化物酶的催化作用，过氧化氢与邻甲氧基苯酚反应，反应产物与过氧化氢含量成正比，測定反应产物的吸光度，根据反应产物吸光度和过氧化氢浓度的标准曲线，计算得到过氧化氢的含量。
具体实施方式
:下面对本发明做进ー步详细说明。实施例1:准确称量已经标定的过氧化氢溶液，配制1000mg/L的标准使用液。配制100mg/L的标准中间液。分别配制含0、l、2、5、10、20mg/L的过氧化氢标准使用液20mL，转移到25mL比色管中，加入2mL过氧化物酶试剂溶液，在37°C水浴中恒温20min，冷却至室温。用二次水定容至25mL，井分别于470nm波长处，测试所得溶液的吸光度。以吸光度为Y轴，过氧化氢浓度为X轴作标准曲线，得标准曲线回归方程。实施例2:分析步骤:移取某品牌袋装鲜牛奶20mL于50mL容量瓶中，依次加入5mL硫酸锌溶液和5mL亚铁氰化钾溶液,混匀，加水定容至50mL,静置20min,用滤纸过滤得到滤液,然后用0.01 %氢氧化钠溶液调节pH值至7.6，滤纸过滤，滤液即为试液，移取20mL试液于25mL容量瓶中，加入2mL过氧化物酶试剂溶液，摇匀，在37°C水浴中恒温20min，溶液显浅红色，冷却至室温，定容到25mL，在470nm处测定吸光度，根据实施例1过氧化氢的标准曲线方程，计算该样品中含过氧化氢5.78mg/L。该方法定量限为2.0mg/L。实施例3:
分析步骤:取某集贸市场牛百叶，切成小块儿后，食品粉碎机粉碎，称取10.0g(精确至0.0Olg)到50mL容量瓶中，依次加入5mL硫酸锌溶液和5mL亚铁氰化钾溶液，混匀，加水定容至50mL，静置20min，滤纸过滤得到滤液，然后0.01%氢氧化钠溶液调节pH值到
7.6，滤纸过滤，滤液即为试液，移取20mL试液到25mL容量瓶中，加入2mL过氧化物酶试剂溶液，摇匀，在37°C水浴中恒温20min，溶液显粉红色，冷却至室温，定容到25mL，在470nm处测定吸光度，根据实施例1过氧化氢的标准曲线方程，计算该样品中含过氧化氢9.54mg/kgo该方法定量限为5.0mg/kg。上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明专利的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，这些都属于本发明的保护范围；因此，凡跟本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰，均应属于本发明权利要求的覆盖范围。
权利要求
1.一种检测食品中残留过氧化氢的酶-比色法，其特征包括如下步骤: (1)样品中分别加入硫酸锌溶液、亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白和脂肪，混合均匀，定容，静置，过滤，收集滤液； (2)用稀酸或稀碱调节滤液pH值到7.6，过滤； (3)取滤液，加入过氧化物酶试剂溶液，水浴恒温，显色，定容； (4)分光光度法測定吸光度，吸光度与过氧化氢的含量成正比，从而计算样品中过氧化氢的含量。
根据权利要求书I所述的方法，其特征在于，所述的过氧化物酶试剂溶液由辣根过氧化物酶、邻甲氧基苯酚的磷酸盐缓冲液显色剂组成。
全文摘要
本方法公开了一种检测食品中残留过氧化氢的酶-比色法，包括以下步骤称取样品加入硫酸锌和亚铁氰化钾沉淀脂肪和蛋白质，过滤，调节滤液pH值为7.6，再次过滤，滤液加入过氧化物酶试剂溶液，定容，于470nm处测定吸光度，计算样品中过氧化氢的含量。本发明的方法简单、快捷、准确、干扰小。
文档编号G01N21/78GK103091312SQ20131001185
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月14日 优先权日2013年1月14日
发明者宋薇 申请人:厦门谱尼测试有限公司