专利名称：一种检测过氧化氢的荧光探针及其合成方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术及临床医学检测领域，尤其涉及一种检测过氧化氢的荧光探针及其合成方法，另外，本发明还涉及该荧光探针的用途。
背景技术：
自由基是生命活动代谢过程中产生的具有高反应活性的小分子物质，一旦生物体自身不能有效、迅速清除过量存在的自由基，将会极大损伤具有重要生理功能的生物大分子，比如DNA，脂质及蛋白质。研究表明人类常见的几种主要疾病，如癌症、动脉硬化症、神经退化疾病及糖尿病等(Witz G.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，1991，198675；Feig D.I.，Reid T.M.，Leob L.A.，Cancer Res.1994，541890s)；及人类的衰老都与自由基的产生密切相关(Finkl T.，Holbrook N.J.，Nature，2000，408239)。但由于自由基寿命短、含量低、种类多，对其检测仍是生命科学与化学分析领域最困难的问题之一。尤其是高选择性、高灵敏度、实用性强的检测方法尚未见有公布。作为重要活性氧之一的过氧化氢，其识别和检测尤其重要。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种效果较好的检测过氧化氢的荧光探针，为探讨人类疾病及老化的机制，为某些重大疾病的早期诊断与预防，提供良好的辅助手段；目的之二是提供工艺简单、成本低廉的该荧光探针的合成方法；目的之三是提供该荧光探针的用途。
本发明的目的之一可通过如下技术措施来实现本发明用于检测过氧化氢的荧光探针的结构式为
X，Y＝F，Cl，CH3，OCH3R＝苯基，取代苯基。
本发明的目的之二可通过如下技术措施来实现该合成方法按如下步骤进行先将原料按照荧光染料∶磺酰化试剂∶附酸剂＝1∶5～8∶50～80的质量比混合均匀，室温下磁搅拌反应10～15小时；然后再于搅拌下置入2～8倍量冰水中，待生成沉淀后过滤、水洗涤至pH值为中性，得粗品；最后硅胶柱层析分离得纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
本发明的目的之二还可通过如下技术措施来实现所述的荧光染料选自荧光素及其取代衍生物或萘荧光素及其取代衍生物；所述的荧光素取代衍生物选自2’，4’，5’，7’-四氟荧光素或4’，5’-二甲基荧光素；所述的萘荧光素取代衍生物选自2’，5’，8’，11’-四氟萘荧光素或5’，8’-二甲基萘荧光素；所述的磺酰化试剂选自苯磺酰氯或取代苯磺酰氯；所述的取代苯磺酰氯选自对甲基苯磺酰氯或对硝基苯磺酰氯；所述的附酸剂选自三乙胺、吡啶或甲基吡啶。
本发明的目的之三可通过如下技术措施来实现将本发明的检测过氧化氢的荧光探针用于化学体系、化学模拟生物体系中羟基自由基的检测，生物活细胞和活组织内的羟基自由基的分析检测和荧光成像检测，以及临床医学上病变组织中羟基自由基的检测。
本发明的荧光探针用于复杂生物体系中过氧化氢的识别和检测，具有高选择性、高灵敏度和实用性强的积极效果，解决了目前生命科学与化学分析领域中的一大难题；通过荧光探针与过氧化氢的特异性反应，利用共聚焦扫描显微镜实现了细胞内原位过氧化氢直接检测。本发明的荧光探针为研究过氧化氢介导的生化反应、自由基损伤生物大分子的作用机理、损伤与疾病的关系及临床治疗提供了较好的理论基础与实验方法。本发明的方法工艺简单，操作方便，设备投入少，生产和运行成本低。
本发明的重要贡献还在于成功的合成了萘系列远可见-近红外荧光探针(600-900nm)，避开了生物体自身荧光的干扰，为生物样品中低含量的过氧化氢检测提供了可能。而荧光素系列则为食品，环境方面的检测提供了更好的灵敏度。总之，本发明的荧光探针及其合成必将极大促进自由基生物化学领域的发展。
图1是本发明合成的二(对甲基苯磺酸)荧光素酯用于氧化胁迫下小鼠腹膜巨噬细胞内过氧化氢检测的荧光成像。
图2是本发明合成的二(对甲基苯磺酸)萘荧光素酯用于氧化胁迫下小鼠腹膜巨噬细胞内过氧化氢检测的荧光成像。
具体实施例方式
实施例1向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、苯磺酰氯5g、吡啶75mL，室温下磁搅拌反应11小时；然后再于搅拌下置入8倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例2向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、苯磺酰氯8g、吡啶55mL，室温下磁搅拌反应15小时；然后再于搅拌下置入3倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例3向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、苯磺酰氯5.8g、吡啶80mL，室温下磁搅拌反应10小时；然后再于搅拌下置入7倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例4向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、苯磺酰氯7g、吡啶55mL，室温下磁搅拌反应14小时；然后再于搅拌下置入3倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例5向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、对甲基苯磺酰氯5g、吡啶70mL，室温下磁搅拌反应12小时；然后再于搅拌下置入6倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例6向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、对甲基苯磺酰氯8g、吡啶65mL，室温下磁搅拌反应14小时；然后再于搅拌下置入4倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例7向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、对硝基苯磺酰氯7g、吡啶60mL，室温下磁搅拌反应13小时；然后再于搅拌下置入5倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例8向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、对甲基苯磺酰氯5.8g三乙胺75mL，室温下磁搅拌反应11小时；然后再于搅拌下置入8倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例9向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、苯磺酰氯8g、三乙胺55mL，室温下磁搅拌反应15小时；然后再于搅拌下置入3倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例10向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、苯磺酰氯5g、三乙胺80mL，室温下磁搅拌反应10小时；然后再于搅拌下置入7倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例11向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、对甲基苯磺酰氯7g、三乙胺55mL，室温下磁搅拌反应14小时；然后再于搅拌下置入3倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例12向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、对甲基苯磺酰氯6g、三乙胺70mL，室温下磁搅拌反应12小时；然后再于搅拌下置入6倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例13
向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、对硝基苯磺酰氯7g、三乙胺65mL，室温下磁搅拌反应14小时；然后再于搅拌下置入4倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例14向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、对硝基苯磺酰氯6.5g、三乙胺60mL，室温下磁搅拌反应13小时；然后再于搅拌下置入5倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例15向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、苯磺酰氯5.8g、甲基吡啶75mL，室温下磁搅拌反应11小时；然后再于搅拌下置入8倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例16向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、苯磺酰氯8g、甲基吡啶55mL，室温下磁搅拌反应15小时；然后再于搅拌下置入3倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例17向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、对甲基苯磺酰氯5g、甲基吡啶80mL，室温下磁搅拌反应10小时；然后再于搅拌下置入7倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后硅胶柱层析分离得荧光探针纯品。
实施例18向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、对甲基苯磺酰氯7g、甲基吡啶55mL，室温下磁搅拌反应14小时；然后再于搅拌下置入3倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例19向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、对硝基苯磺酰氯7g、甲基吡啶70mL，室温下磁搅拌反应12小时；然后再于搅拌下置入6倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例20向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、对硝基苯磺酰氯6g、甲基吡啶65mL，室温下磁搅拌反应14小时；然后再于搅拌下置入4倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例21向一单口烧瓶中加入荧光素1.0g、对硝基苯磺酰氯5g、甲基吡啶60mL，室温下磁搅拌反应13小时；然后再于搅拌下置入5倍量冰水中，待生成沉淀后过滤，滤去上清液，用水洗涤滤饼至pH值为中性，得荧光探针粗品；最后，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
实施例22向一单口烧瓶中加入2’，4’，5’，7’-四氟荧光素1.0g，其他分别同实施例1～21。
实施例23
向一单口烧瓶中加入4’，5’-二甲基荧光素1.0g，其他分别同实施例1～21。
实施例24向一单口烧瓶中加入萘荧光素1.0g，其他分别同实施例1～21。
实施例25向一单口烧瓶中加入2’，5’，8’，11’-四氟萘荧光素1.0g，其他分别同实施例1～21。
实施例26向一单口烧瓶中加入5’，8’-二甲基萘荧光素1.0g，其他分别同实施例1～21。
权利要求
1.一种检测过氧化氢的荧光探针，其特征在于该荧光探针的结构为 X，Y＝F，Cl，CH3，OCH3R＝苯基，取代苯基。
2.一种检测过氧化氢的荧光探针的合成方法，其特征在于先将原料按照荧光染料∶磺酰化试剂∶附酸剂＝1∶5～8∶50～80的质量比混合均匀，室温下磁搅拌反应10～15小时；然后再于搅拌下置入2～8倍量冰水中，待生成沉淀后过滤、水洗涤至pH值为中性，得粗品；最后硅胶柱层析分离得纯品。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于所述的荧光染料选自荧光素及其取代衍生物或萘荧光素及其取代衍生物。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于所述的荧光素取代衍生物选自2’，4’，5’，7’-四氟荧光素或4’，5’-二甲基荧光素。
5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于所述的萘荧光素取代衍生物选自2’，5’，8’，11’ -四氟萘荧光素或5’，8’-二甲基萘荧光素。
6.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于所述的磺酰化试剂选自苯磺酰氯或取代苯磺酰氯。
7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于所述的取代苯磺酰氯选自对甲基苯磺酰氯或对硝基苯磺酰氯
8.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于所述的附酸剂选自三乙胺、吡啶或甲基吡啶。
9.权利要求1所述的检测过氧化氢的荧光探针用于化学体系、化学模拟生物体系中羟基自由基的检测，生物活细胞和活组织内的羟基自由基的分析检测和荧光成像检测，以及临床医学上病变组织中羟基自由基的检测。
全文摘要
本发明提供了一种检测过氧化氢的荧光探针及其合成方法，该方法按如下步骤进行先将原料按照荧光染料∶磺酰化试剂∶附酸剂＝1∶5～8∶50～80的质量比混合均匀，室温下磁搅拌反应10～15小时；然后再于搅拌下置入2～8倍量冰水中，待生成沉淀后过滤、水洗涤至pH值为中性，得粗品；最后硅胶柱层析分离得纯品。
文档编号G01N21/00GK1844124SQ20061004356
公开日2006年10月11日 申请日期2006年4月11日 优先权日2006年4月11日
发明者唐波, 徐克花, 黄辉 申请人:山东师范大学