专利名称：定量检测肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种定量检测肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法及检测试剂盒。
背景技术：
目前用于检测肌氨酸的方法主要有液相色谱或气象色谱与质谱联用检测法、肌氨酸氧化酶荧光检测法、毛细管电泳电化学发光检测法、肌氨酸氧化酶分光光度检测法。色谱-质谱联用检测法虽然检测灵敏度、准确度、精密度均较高，但由于色谱-质谱设备昂贵，检测成本较高，检测速度慢，很难大批量检测，且操作复杂一般人很难掌握。因此，常应用于科研，很难应用临床大样本量诊断检测。 肌氨酸氧化酶荧光检测法、毛细管电泳电化学发光检测法其检测灵敏度、准确度、精密度略低于色谱-质谱联用检测法，但也可满足临床的需求。此两种方法的检测成本较色谱-质谱联用检测法已大大降低，但在检测时仍需购置专门的检测装置，如荧光检测器、毛细光电泳仪等专门设备。并且人工操作的部分很高，对应用于常规临床检测来讲仍有一定的难度。肌氨酸氧化酶分光光度检测法，其检测成本低、可应用于目前任何一种全自动生化分析仪，可应用于临床高速大样本量的检测需要。但由于以往的色原灵敏度低，造成该方法的灵敏度很难满足临床的需求。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种成本低、灵敏度高的定量检测肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法，本发明的另一目的是提供一种肌氨酸检测试剂盒。为实现上述目的，本发明定量检测肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法，具体为D肌氨酸+Η2θ+θ2議乂化》^甘氨酸+甲酸+H2O2;2)Η202+4-氨基安替比林+色原——— 醌亚胺类有色物质+H2O;反应结束后有醌亚胺类有色物质生成造成吸光度的变化，并且该吸光度的变化与肌氨酸的浓度成正比，以检测得到的样本吸光度值与校准曲线对比，得到相应的样本浓度数值；其中，一试剂Rl浓度为缓冲液50-100mmol/L，4-氨基安替比林2-4mmol/L，过氧化物酶>20KU/L ;二试剂R2浓度为缓冲液50-1OOmmoI/L，色原3-5mmol/L，肌氨酸氧化酶5-10KU/L ;R1/R2试剂比例为3/1-4/1，肌氨酸样本与总体试剂量的比例为1/25 1/20。进一步，所述缓冲液包括Tris-HCL缓冲液、磷酸盐缓冲液或N-三羟基代甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液，缓冲液PH值为7. (T9. O。进一步，所述色原包括N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3_甲基苯胺钠盐(TOOS)或N，N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐(TODB)或N- (2-羟基-3-磺丙基)-3’ 5- 二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)。进一步，不同所述色原所采用的检测主波长不同，副波长均使用相同的700nm波长。进一步，所述TOOS所采用的检测主波长为550-570nm，所述TODB所采用的检测主波长为530-540nm，所述HDAOS所采用的检测主波长为580_590nm。进一步，所述步骤I)、2)反应温度为3(T40°C，反应时间控制在8-10分钟，吸光度监测点控制在加入R2试剂后3(Γ66秒开始监测反应吸光度值直至反应结束。一种用于实施上述非诊断性方法的肌氨酸检测试剂盒，包括的试剂及其浓度为一试剂 Rl 缓冲液50_100mmol/L ；4-氨基安替比林2_4mmol/L ;
过氧化物酶>20KU/L;二试剂 R2 缓冲液50-1OOmmo I/L ；色原3_5mmol/L ；肌氨酸氧化酶5-10KU/L。进一步，所述缓冲液包括Tr i s-HCL缓冲液、磷酸盐缓冲液或N-三羟基代甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液，缓冲液PH值为7. (T9. O。进一步，所述色原包括N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3_甲基苯胺钠盐(TOOS)或N，N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐(TODB)或N- (2-羟基-3-磺丙基)-3’ 5- 二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)。本方法在原有肌氨酸氧化酶分光光度检测法的基础上，着重改善原有方法灵敏度不足以满足临床检测的缺点，使得本检测方法既保留了以往分光光度检测法成本低、可在全自动生化仪上使用的优点外，也改善其检测灵敏度低的缺点，使目前的检测灵敏度提升到10tl0_6mol/L，已能满足临床检测的需求(目前研究表明正常人肌氨酸水平10_6mol/L水平)。
图I为实施例I中的校准曲线；图2为实施例I中的样本反应曲线；图3为实施例2中的校准曲线；图4为实施例3中的样本反应曲线。
具体实施例方式下面，参考附图，对本发明进行更全面的说明，附图中示出了本发明的示例性实施例。然而，本发明可以体现为多种不同形式，并不应理解为局限于这里叙述的示例性实施例。而是，提供这些实施例，从而使本发明全面和完整，并将本发明的范围完全地传达给本领域的普通技术人员。检测原理
肌氨酸+H20+02 ■g—- 甘氨酸+甲酸+H2O2
H202+4-氨基安替比林+色原■■■■■■■■■■ 醌亚胺类有色物质+H2O反应结束后有醌亚胺类有色物质生成造成吸光度的变化，并且该吸光度的变化与肌氨酸的浓度成正比。反应体系中各反应物质浓度试剂浓度Rl (一试剂)缓冲液50-100mmol/L
4-氨基安替比林2_4mmol/L过氧化物酶>20KU/LR2 (二试剂)缓冲液SOmmoI /I,色原3_5mmol/L肌氨酸氧化酶 5-10KU/L样本试剂反应体积比例R1/R2试剂比例为3/1，样本与总体试剂量的比例为1/5 1/20。缓冲液反应体系用缓冲液可以使Tris-HCL缓冲液、磷酸盐缓冲液、N-三羟基代甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液。缓冲液PH值调整在7. O 9. O左右。5. 4色原，色原可选用目前的新型色原(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)或N，N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐(TODB)或N-(2-羟基-3-磺丙基)_3’ 5- 二甲氧基苯胺钠盐(HDA0S))。检测波长不同色原所采用的检测主波长不同，副波长相同均使用700nm波长，TOOS 550-570nm ；TODB530_540nm ；HDAOS 580_590nm。反应温度最佳反应温度为30 40°C。反应时间与吸光度监测时间反应时间控制在8-10分钟，吸光度监测点控制在加入R2试剂后30 66秒开始监测反应吸光度值直至反应结束。实验步骤I、校准品配置使用肌氨酸纯品配制浓度为6. 25umol/L> 12. 5umol/L、25umol/L、50umol/L、100umol/L的溶液最为校准品溶液。2、空白吸光度值检测(AO ):I)吸取纯水溶液加入Rl试剂溶液,将两溶液混匀反应,开始监测反应时间，反应温度37 °C。2)待上述溶液反应3分钟后，加入R2试剂溶液，将溶液混匀反应，继续监测反应时间，反应温度37 C。3)待整体反应时间到达30 66秒后，以不同色原物质的最大吸收波长为主波长，以700nm波长为副波长，开始监测吸光度值记为A1=A1 ±-A1 ^继续监测反应时间，待整体反应结束后(8-10分钟)再次监测吸光度值记为A2=A2±-A2ffl。4)吸光度值计算=Aq=A2-Aiq3、校准品吸光度值检测(Asn):I)吸取校准品溶液加入Rl试剂溶液，将两溶液混匀反应，开始监测反应时间，反应温度37 °C。2)待上述溶液反应3分钟后，加入R2试剂溶液，将溶液混匀反应，继续监测反应时间，反应温度37 C。3)待整体反应时间到达30 66秒后，以不同色原物质的最大吸收波长为主波长，以700nm波长为副波长，开始监测吸光度值记为A1=A1 ±-A1 ^继续监测反应时间，待整体反应结束后(8-10分钟)再次监测吸光度值记为A2=A2±-A2ffl。
4)吸光度值计算=Asn=A2-A1-Ac^4、标准曲线绘制以五个校准品溶液的配置浓度为横坐标，以检测得到的五个校准品溶液的吸光度值(Asn)为纵坐标，绘制校准曲线。5、样本检测I)吸取样本溶液加入UlRl试剂溶液，将两溶液混匀反应，开始监测反应时间，反应温度37 °C。2)待上述溶液反应3分钟后，加入R2试剂溶液，将溶液混匀反应，继续监测反应时间，反应温度37 C。3)待整体反应时间到达30 66秒后，以不同色原物质的最大吸收波长为主波长，以600nm波长为副波长，开始监测吸光度值记为A1=A1 ±-A1 ^继续监测反应时间，待整体反应结束后(8-10分钟)再次监测吸光度值记为A2=A2±-A2ffl。4)吸光度值计算-A样本=k2-k「k0O6、样本浓度计算以检测得到的样本吸光度值在校准曲线上查找相应的位置，得到相应的浓度数值。本发明方法特性I)使用了目前较为优秀的色原，不同的色原其检测灵敏度有着很大的差异，使用高灵敏色原后可以有效的提升检测的灵敏度，以满足临床检测的需求。2)反应监测点的选取，使用规定时间检测法，选取整个反应中最稳定、线性程度最高的一段时间用于吸光度值的读取，避免了由于反应波动造成的误差，也从一方面提高了检测的灵敏度。 3)双试剂的选用，使用液体双试剂反应体系，可有效的特高试剂的整体稳定性，减少试剂之间的非特异反应，避免自发反应的出现。4)本发明只涉及到检测肌氨酸水平，并不涉及关于肌氨酸在疾病诊断中应用的问题，因此不涉及疾病的诊断和治疗方法。本发明的有益效果本方法在原有肌氨酸氧化酶分光光度检测法的基础上，着重改善原有方法灵敏度不足以满足临床检测的缺点。选用目前检测灵敏度较高、稳定性较好的色原物质，使用双试剂检测法，合理分配各反应物质在整体反应体系中的浓度，检测吸光度数据读取时采用固定时间点读取法。使检测灵敏度较以往分光光度检测法大大提升。因此，使得本检测方法既保留了以往分光光度检测法成本低、可在全自动生化仪上使用的优点外，也改善其检测灵敏度低的缺点，使目前的检测灵敏度提升到10_7 10_6mol/L，已能满足临床检测的需求(目前研究表明正常人肌氨酸水平10_6mol/L水平)。实施例I :本实施例试剂盒组成Rl (一试剂)缓冲液SOmmoI /I,4-氨基安替比林2.08mmol/L 过氧化物酶>20KU/LR2 (二试剂)缓冲液SOmmoI /I,TOOS4. Immol/I,肌氨酸氧化酶8KU/L在全自动生化仪上设定反应参数，加样量8ul，Rl试剂150ul，R2试剂50ul，检测主波长570nm,副波长700nm。反应方向向上正反应,吸光度读数计算方式，固定时间法，读数点 12 点和 27 点。校准品浓度 6. 25umol/L、12. 5umol/L、25umol/L、50umol/L、100umol/L，校准曲线计算方式LOGISTIC。校准曲线见图I。使用上述检测试剂检测I例尿标本，检测结果I. 563umol/L。反应曲线见图2。实施例2 本施实施例试剂盒组成Rl (一试齐[J)缓冲液SOmmoI /I,4-氨基安替比林2. 78mmol/L过氧化物酶>20KU/LR2 (二试剂)缓冲液SOmmoI /I,TODB4. Bmmol /I,肌氨酸氧化酶10KU/L在全自动生化仪上设定反应参数，加样量IOul，Rl试剂150ul，R2试剂50ul，检测主波长540nm,副波长700nm。反应方向向上正反应,吸光度读数计算方式，固定时间法，读数点 12 点和 27 点。校准品浓度 6. 25umol/L、12. 5umol/L、25umol/L、50umol/L、100umol/L，校准曲线计算方式LOGISTIC。校准曲线见图3。实施例3 本施实施例实施例试剂盒组成Rl (一试剂)缓冲液SOmmoI /I,4-氨基安替比林2. 08mmol/L
过氧化物酶>20KU/LR2 (二试剂)缓冲液SOmmoI /I,TOOS4. Immol/I,肌氨酸氧化酶10KU/L在全自动生化仪上设定反应参数，加样量IOul，Rl试剂150ul，R2试剂50ul，检测主波长570nm,副波长700nm。反应方向向上正反应,吸光度读数计算方式，固定时间法，读数点 12 点和 27 点。校准品浓度 6. 25umol/L、12. 5umol/L、25umol/L、50umol/L、100umol/L，校准曲线计算方式LOGISTIC。检测一例尿标本，结果6.985um/L。反应曲线见图4.
实施例4:I.试剂成分及浓度Rl (一试剂)缓冲液(Tris-HCl)PH8. O 50-100mmol/L4-氨基安替比林3mmol/L过氧化物酶>20KU/LR2 (二试剂)缓冲液(Tris-HCl)PH8. O 50-100mmol/L色原(TOOS)4mmol/L肌氨酸氧化酶8KU/L其中，(I)TOOS N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(2)缓冲液的替代品磷酸盐缓冲液、N-三羟基代甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液。缓冲液PH值调整在7. O 9. O左右。(3)色原的替代品N，N-双(4-磺丁基)-3_甲基苯胺二钠盐(TODB)或N-(2_羟基-3-磺丙基)-3' 5- 二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)。2.手工检测肌氨酸方法(色原选择T00S)2. I样本试剂使用量加入样本量20ul加入Rl试剂量300ul加入R2试剂量IOOul2. 2实验步骤2. 2. I将样本20ul和Rl试剂300ul加入反应杯，混匀置于37°C孵育反应5分钟。2. 2. 2将R2试剂IOOul加入反应杯中，混匀置于37°C孵育反应3分钟，在主波长540nm和副波长700nm下读取吸光度值为Al主和Al副。2. 2. 3继续在37 °C孵育反应2分钟，在主波长540nm和副波长700nm下读取吸光度值为A2王和A2副。计算Δ A= (A2王-A2副)-Al王-Al )。3.全自动生化分析仪检测方法(以贝克曼AU5400生化仪为例，色原选择T00S)，样本量10ulRl 试剂量150ulR2 试剂量50ul主波长540nm
副波长700nm反应方向( + )正方向吸光度读数计算方式fixed吸光度读取点12，27。4.不同色原最大吸收波长范围TOOS 550_570nm,TODB 530_540nm,
HDAOS 580_590nm。5.校准程序5. I校准品使用肌氨酸纯品配制浓度为6. 25umol/L、12. 5umol/L、25umol/L、50umol/L、IOOumoI/L的溶液最为校准品溶液。5. 2检测校准品，手工法绘制以浓度为横坐标、相应吸光度值为纵坐标的标准曲线。仪器分析(以以贝克曼AU5400生化仪为例)，校准方式为5AB，校准曲线计算方式选择LOGISTIC。6.样本浓度计算以检测得到的样本吸光度值ΛΑ样本在校准曲线上查找相应的位置，得到相应的浓度数值。
权利要求
1.定量检测肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法，其特征在于，该方法具体为 1)肌氨酸+H20+02-aa8M··__ 甘氨酸 + 甲酸+H2O2; 2)H202+4-氨基安替比林+色原-獲·- 醌亚胺类有色物质+H2O; 反应结束后有醌亚胺类有色物质生成造成吸光度的变化，并且该吸光度的变化与肌氨酸的浓度成正比，以检测得到的样本吸光度值与校准曲线对比，得到相应的样本浓度数值； 其中，一试剂Rl浓度为缓冲液50-100mmol/L，4-氨基安替比林2-4mmol/L，过氧化物酶>20KU/L ;二试剂R2浓度为缓冲液50-1OOmmoI/L，色原3-5mmol/L，肌氨酸氧化酶5-10KU/L ;R1/R2试剂比例为3/1-4/1，肌氨酸样本与总体试剂量的比例为1/25 1/20。
2.如权利要求I所述的非诊断性方法，其特征在于，所述缓冲液包括Tris-HCL缓冲液、磷酸盐缓冲液或N-三羟基代甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液，缓冲液PH值为7. (T9. O。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述色原包括N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)或N，N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐(TODB)或N-(2-羟基-3-磺丙基)_3’ 5- 二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，不同所述色原所采用的检测主波长不同，副波长均使用相同的700nm波长。
5.如权利要求4所述的非诊断性方法，其特征在于，所述TOOS所采用的检测主波长为550-570nm,所述TODB所采用的检测主波长为530_540nm，所述HDAOS所采用的检测主波长为 580_590nm。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤1)、2)反应温度为3(T40°C，反应时间控制在8-10分钟，吸光度监测点控制在加入R2试剂后3(Γ66秒开始监测反应吸光度值直至反应结束。
7.一种用于实施上述方法的肌氨酸检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括的试剂及其浓度为 一试剂Rl 缓冲液50-1OOmmo I/L ； 4-氨基安替比林 2-4mmol/L; 过氧化物酶>20KU/L ； 二试剂R2 缓冲液50mmol/L ； 色原3_5mmol/L ； 肌氨酸氧化酶 5-10KU/L。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括Tris-HCL缓冲液、磷酸盐缓冲液或N-三羟基代甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液，缓冲液PH值为7. (T9. O。
9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述色原包括N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)或N，N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐(TODB)或N- (2-羟基-3-磺丙基)-3' 5- 二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)。
全文摘要
本发明公开了一种定量检测肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法及检测试剂盒，本发明在原有肌氨酸氧化酶分光光度检测法的基础上，着重改善原有方法灵敏度不足以满足临床检测的缺点。选用目前检测灵敏度较高、稳定性较好的色原物质，使用双试剂检测法，合理分配各反应物质在整体反应体系中的浓度，检测吸光度数据读取时采用固定时间点读取法。使检测灵敏度较以往分光光度检测法大大提升。因此，使得本检测方法既保留了以往分光光度检测法成本低、可在全自动生化仪上使用的优点外，也改善其检测灵敏度低的缺点，使目前的检测灵敏度提升到10-7～10-6mol/L，已能满足临床检测的需求。
文档编号C12Q1/28GK102901711SQ20121042988
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者肖飞, 刘明, 王萌, 王大光, 许宏涛, 邹丽辉, 黄薇 申请人:卫生部北京医院