专利名称：一株产紫杉醇的菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株赤霉菌菌株。
背景技术：
紫杉醇最初是从红豆杉树皮和木材中分离提纯得到的天然抗肿瘤活性成分，属于四环二帖类物质，它的系统名为5 β ,20-环氧-1,2 α，4,7 β ,10 β , 13 α六轻紫杉烷-II-烯-9酮-4，10- 二乙醇酯-2-苯甲酸酯-13-[ (2R，3S) N-苯甲酰-3'-苯基异丝氨酸酯，分子式为C-47H51N014。临床实验证明紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、头颈部肿瘤等有明显疗效。
目前临床上使用的紫杉醇主要来源于红豆杉属植物，由于野生红豆杉属植物生长缓慢，天然更新能力弱，属濒危一级保护植物，资源十分有限，采摘多年生野生红豆杉属植物需国家林业局审批，手续繁琐麻烦；而且在红豆杉属植物不同部位中紫杉醇含量又很低，造成紫杉醇紧缺、价格昂贵，药源不足已成为紫杉醇的生产瓶颈。因此，国内外学者积极研究开发紫杉醇的新药源。目前的方法主要有红豆杉人工栽培、寻找红豆杉的替代植物、化学全合成和半合成、组织与细胞培养、微生物发酵等途径，其中利用微生物发酵法生产紫杉醇具有诸多优点，如容易放大更利于工业化生产；可以通过改善培养环境和改进技术提高产量；易于利用如基因工程等较多手段筛选高产菌株；微生物相对于植物生长迅速、易于培养、应用的培养基也比较便宜，在紫杉醇化学全合成和半合成工艺复杂、成本较高的背景下，微生物发酵法生产紫杉醇成为当前紫杉醇药源开发中的最新热点；但是现有产紫杉醇的菌株，有些菌株产孢子时间较晚；有些菌株产孢子量低，或不产孢子，仅以菌丝体传代；有些菌株需要使用成本非常高的促孢子生成培养基，加大了生产成本。但是，工业化大规模发酵生产时需要以孢子计数为基础的某定量接种量作为前提，而采用菌丝体作为种子时，从目前技术来看接种是不能准确定量的，一定量的培养基需要与之适应的接种量，才能使菌体生长良好，从而使目标产物产量更高。一旦接种量掌握不好，轻则菌体生长不良，目标产物产量下降，利润降低，重则在浪费生产原料的情况下目标产物产量不足，从而收不回成本，更不利于工业化大规模发酵生产接种。从保存时间和保存质量上来看，以孢子保存方式保存菌种，保存时间长，保存质量好，要优于不产孢子的菌种以菌丝体保存的方式。另外，进行真菌物理化学诱变时，通常对象为其孢子，产孢子量大的菌更易获得大数量的诱变基数，从而保证高突变率，加快更适宜工业化生产、具优良培养性状、产物中杂质含量低、易于提取、最好兼具目标物高产的优良菌株的筛选，相对于产孢子量低的菌株，产孢子量大的菌株经过诱变获得优良菌株的成本更低。野生山榛子从不被植物病虫害侵犯，山榛子的枝叶和树皮中含有紫杉醇等紫杉烷类、黄酮类、鞣质、多酚类等多种功能性成分；已有许多研究表明植物内生真菌可以产生与寄主植物相同或相似的功能性成分。针对产紫杉醇内生菌的分离筛选工作开展的较多，但未见有产紫杉醇赤霉菌的报道，另外产孢量大、产孢迅速、保证能够以孢子接种方式进行工业化发酵生产从而使生产成本低的产紫杉醇菌未见报道。
发明内容
本发明目的是解决现有产紫杉醇的菌株，存在不产孢子或产孢量低，产孢慢，生产孢子或种子成本高，不利于工业化大规模发酵生产接种的问题，而提供一株产紫杉醇的菌株。本发明产紫杉醇的菌株，它为赤霉菌(Gibberella sp. ) JFHd-Ι,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年4月10日，保藏编号为CGMCC No. 5980。本发明中赤霉菌(Gibberella sp. ) JFHd-I在PDA固体培养基上生长良好，培养至三天，菌落直径可达I. 5 I. 8cm,表面无渗出液，菌丝为白色絮状，菌落中央微微凸起， 质地疏松，呈放射状褶皱，菌落呈淡黄色，培养三天后，菌落表面有黑色孢子生长，培养至七天，菌落可长满整个平板，且有大量黑色的孢子生成，无特殊气味，边缘较整齐，菌落背面中间呈白色边缘为淡黄色。赤霉菌(Gibberella sp.) JFHd-I在PDA液体培养基培养3 15天后，培养液中长满白色菌丝球，溶液表面液面层及摇瓶壁上有大量黑色的孢子存在。在光学显微镜下观察，菌丝呈长丝状，菌丝中间无隔。分生孢子呈圆形或椭圆形，大小为(2. O μ m 3. O μ m) X (2. O μ m 3. O μ m)。本发明中赤霉菌(Gibberella sp.) JFHd-I在PDA培养基生长，最适生长温度为25 28°C，最适生长pH值为5 7。本发明中赤霉菌(Gibberella sp. ) JFHd-1，其ITS序列，PCR产物纯化后，经NCBI数据库序列比对，与赤霉菌属(Gibberella sp.)内各个种之间有极高的同源性，同源性为98%以上，通过结合菌体形态特征、生长条件确定赤霉菌JFHd-I属于赤霉菌属(Gibberella sp.)。本发明中赤霉菌JFHd-I属于赤霉菌属(Gibberella sp.),保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年4月10日，保藏编号为CGMCC No. 5980。本发明中赤霉菌(Gibberella sp.) JFHd-I能够产生紫杉醇，赤霉菌JFHd-I发酵产物经乙酸乙酯萃取后，应用超高效液相色谱仪和三重四极杆质谱仪联用技术进行了紫杉醇检测。本发明中赤霉菌(Gibberella sp. ) JFHd-I不仅产紫杉醇,而且在比较几种常规培养基后，采用廉价易得的PDA培养基培养即可快速大量的生成孢子，因此更适宜进行生物工程育种(即对菌株进行物理化学诱变)，从而加快具优良培养性状、更适宜工业化生产、产物中杂质含量低、易于提取、最好兼具目标物高产的优良菌株的筛选，间接的降低了紫杉醇的生产成本。
图I为具体实施方式
一中赤霉菌(Gibberella sp.)JFHd-I的菌落正面形态图；图2为具体实施方式
一中赤霉菌(Gibberella sp.)JFHd-I的菌丝形态图；图3为具体实施方式
一中紫杉醇对照品(A)的全离子扫描图；图4为具体实施方式
一中紫杉醇对照品(A)的多反应监测色谱图5为具体实施方式
一中供试品⑶的多反应监测色谱图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式产紫杉醇的菌株,它为赤霉菌(Gibberella sp.)JFHd-Ι，保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年4月10日，保藏编号为CGMCC No. 5980。本实施方式中具体的保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101。赤霉菌(Gibberella sp.)JFHd-I的分类命名为赤霉菌 Gibberella sp.。本实施方式中赤霉菌(Gibberella sp. ) JFHd-I在PDA固体培养基上生长良好，培养至三天，菌落直径可达I. 5 I. 8cm，表面无渗出液，菌丝为白色絮状，菌落中央微微凸起，质地疏松，呈放射状褶皱，菌落呈淡黄色，培养三天后，菌落表面有黑色孢子生长，培养至七天，菌落可长满整个平板，且有大量黑色的孢子生成，无特殊气味，边缘较整齐(见图I)，菌落背面中间呈白色边缘为淡黄色。赤霉菌(Gibberella sp.) JFHd-I在PDA液体培养基培养3 15天后，培养液中长满白色菌丝球，溶液表面液面层及摇瓶壁上有大量黑色的孢子存在。在光学显微镜下观察，菌丝呈长丝状，菌丝中间无隔(见图2)。分生孢子呈圆形或捕圆形，大小为(2. O μ m 3. O μ m) X (2. O μ m 3. O μ m)。本实施方式中赤霉菌(Gibberella sp. ) JFHd-I在PDA培养基生长，最适生长温度为25 28°C，最适生长pH值为5 7。本实施方式中产紫杉醇的菌株它为赤霉菌(Gibberella sp. ) JFHd-I，该菌株自榛属植物根茎皮内分离纯化得到，榛属植物为野生平榛树，它采自哈尔滨宾县地区，植株健壮，无病虫害，其样本现存于黑龙江大学生命科学学院108实验室；它按以下步骤进行分离纯化培养一、将带部分木质部的平榛树的树皮用无菌水冲洗去掉杂质，然后用质量浓度为75%的酒精浸泡lmin，再用无菌水冲洗掉酒精，然后用无菌剪刀剪成面积为O. 5cmX0. 5cm的榛树皮小块；二、将榛树皮小块放置于PDA琼脂固体培养基平板上，在28°C条件下恒温培养至树皮小块周围明显长出菌丝；三、采用尖端菌丝挑取法将菌接种于PDA琼脂固体培养基，在28°C恒温条件下培养3 5天，挑取单菌落，用PDA琼脂固体培养基平板划线培养法，经多次分离、筛选、纯化，得到可以产生紫杉醇的赤霉菌JFHd-1。对分离纯化得到的赤霉菌JFHd-I进行分子生物学鉴定，按以下步骤进行提取菌株的总DNA，采用真菌通用引物ITS1、ITS4扩增赤霉菌JFHd-I rDNA ITS序列，PCR产物纯化后,经NCBI数据库序列比对，与赤霉菌属(Gibberella sp.)内各个种之间有极高的同源性，同源性为98%以上，通过结合菌体形态特征、生长条件确定赤霉菌JFHd-I属于赤霉菌属(Gibberella sp.)。将本实施方式的赤霉菌JFHd-I接种于种子培养基(PDA琼脂固体培养基)，于28°C培养2天，然后转接于装有200mL发酵培养基(PDA液体培养基)的500mL三角瓶中，于28°C、180r/min条件下摇瓶培养10天，收集发酵产物。对上述赤霉菌JFHd-I的发酵产物进行紫杉醇检测，具体如下采用均质机将赤霉菌JFHd-I发酵液均质后，取IL用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，浓缩至干，用乙腈溶解定容至lmL，0.22ym微孔滤膜过滤除去固形物，制得供试品(B)溶液。将供试品(B)溶液进行液质联用分析，色谱条件为使用Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪，WaterszXTerra MS C18色谱柱(2. ImmX 150mm，5 μ m)，流动相为乙腈和纯水，进行梯度洗脱(程序见表I);流速O. 3mL/min,柱温为30°C ;进样量为3. O μ L。质谱条件为使用Waters QuattroPremier三重四极杆质谱仪，采用电喷雾电离正离子采集模式(ESI+)，在多反应监测(MRM)模式下检测。毛细管电压为3. OkV，离子源温度120°C，脱溶剂温度300°C，脱气流量600L/h,锥孔气流量50L/h，锥孔电压为25V，碰撞能量为35eV，监测离子对为854/286。在ESI+的电离方式下，紫杉醇对照品(A)可形成稳定的[Μ+Na]+分子离子峰见 图3，采用MRM模式测定紫杉醇对照品(A)和供试品(B)的MRM色谱图见图4和图5。在多反应监测(MRM)模式下，以286(m/z)作为定量离子，按前述液质联用分析条件进行测定。以进样质量浓 度(X)为横坐标，离子峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归得标准曲线Y = 32 051X+195 728，相关系数r为O. 998，取赤霉菌JFHd-I发酵液供试品溶液共6份，测得发酵液中紫杉醇平均浓度为 12. 5μ g/L。表I
权利要求
1.一株产紫杉醇的菌株，其特征在于它为赤霉菌(Gibberella sp.) JFHd-I,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年4月10日，保藏编号为CGMCC No. 5980。
全文摘要
一株产紫杉醇的菌株，它涉及一株赤霉菌菌株。它为了解决现有产紫杉醇的菌株，存在不产孢子或产孢量低，产孢慢，生产孢子或种子成本高，不利于工业化大规模发酵生产接种的问题。赤霉菌(Gibberella sp.)JFHd-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年4月10日，保藏编号为CGMCC No.5980。本发明中赤霉菌JFHd-1不仅产紫杉醇，且可快速大量的生成孢子，更适宜进行生物工程育种，加快具优良培养性状、更适宜工业化生产、产物中杂质含量低、易于提取、最好兼具目标物高产的优良菌株的筛选，间接的降低了紫杉醇的生产成本。
文档编号C12N1/14GK102876591SQ20121042817
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者金涛, 李冲伟 申请人:黑龙江大学