专利名称：复合诱变筛选获得高效转化DHEA为3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过复合诱变亚麻刺盘孢得到高转化转化DHEA为3β，7α，15α -三羟基雄留-5-烯-17-酮突变菌株的方法，属于生物工程中发酵技术领域。
背景技术：
去氢表雄酮(DHEA)是自然界生物体内重要的活性物质，对生命的代谢活动具有重要的调节作用，其衍生物3 β，7 α，15 α -三羟基雄甾_5_烯_17_酮是第四代口服避孕药屈罗酮的前体化合物，具有高效、低毒、无副作用等优势，同时还具备非避孕临床益处，如控制体重、改善肤质等。目前，屈螺酮为全球销量第一的女用口服避孕药，全球年销售额达14. 5亿欧元，故3β，7α，15 α -三羟基雄甾_5_烯_17_酮作为其医药中间体，应用前景十分看好。传统合成屈罗酮的方法是以醋酸去氢表雄酮为底物，通过18步的化学反应合成，其特点是需要高温高压、设备投资大、产品收率低成本高，且后期产品回收纯化工艺复杂繁琐、对环境不友好等。近些年来，随着生物技术的迅猛发展，生物转化法由于具备反应条件温和，安全低耗易操作、转化率相对较高且环境友好等特点而吸引了众多国内外研究者。但是也存在着微生物转化效率不高、底物投料浓度低、转化反应专一性差，副产物较多和提取过程中有机溶剂使用量大造成环境污染等缺点。这些不足之处直接成为3 β，7 α，15 α -三羟基雄留-5-烯-17-酮工业生产中的瓶颈，因此解决这些问题，是留体工业大规模工业化的关键。复合诱变包括两种或多种诱变剂的先后使用、同一种诱变剂的重复使用、两种或多种诱变剂的同时使用。由于复合诱变与单因素诱变相比具有独特的优势，因此在诱变育种中较多使用。紫外诱变是目前普遍采用的传统诱变方法，它的诱变机理主要是它引起DNA的变化引起的。由于DNA强烈吸收紫外线，尤其是它链上的碱基，紫外线引起DNA结构变化的形式很多，如DNA链的断裂、DNA分子内和分子间的交联、核酸与蛋白质的交联及嘧啶产生两类化合物，即水合物和二聚体。二聚体大多数为胸腺嘧啶二聚体Τ=Τ，但也有T=C和C=C 二聚体，其中T=T的形成是改变DNA生物活性的重要原因。氮离子注入是指用能量为10 1000 keV量级的氮离子束入射到真菌中去，入射离子逐渐损失能量，最后停留在材料中，与生物的相互作用不仅有物理的和化学的，而且还会引起强烈的生物效应，从而促使生物产生各种变异。N-离子注入过程中与生物体产生复杂的物理、化学和生物学效应。注入的离子通过动量传递、质量沉积、动能沉积和电荷交换效应联合作用而 对遗传物质产生直接或间接的损伤，同时生物体内各种修复机制被激活，对损伤进行修复，在修复过程中可能出错或者损伤超过了生物体的修复能力，就会引起突变和致死，突变就可能被稳定遗传下来。由于其在微生物诱变中的高效性，它正在得到越来越广泛的使用。
本发明通过紫外线和氮离子注入复合诱变，获得底物投料浓度高、转化率高、副产物较少的菌株，为微生物转化留体药物工业化提供了基础。
发明内容
本发明的发明人通过对实验室原有菌株Iini进行复合诱变,获得一株转化效率高、副产物少的突变株，并且测定了突变株18S rDNA、ITS基因序列。并将该氣取命名为{Colletotrichum linf) ST-1 ,于2012年4月24号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6051。本发明提供的亚麻刺盘孢突变株7i/ i) ST-1, CGMCC No. 6051的生理形态及18S rDNA、ITS基因序列如下菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上采用打孔器接种法接种，孔径0.5 cm，在30 °C培养4 d后菌落直径为5. 2 cm，平均生长直径为13.0 mm/d;培养7 d后，菌落边缘呈橙红色，中间呈灰黑色、褶皱隆起，可产生橙红色色素；菌丝与培养基连接紧密，不易挑取；分生孢子梗从菌丝层或子座生出，常不分枝也不分隔，密集成栅栏状，分生孢子常埋于胶质中，群集时使孢子成橙色等。分生孢子盘有刚毛，刚毛一般生于分生孢子盘的周围，分生孢子椭圆形或新月形，直或微弯。18SrDNA基因序列如下
I GTTCGACTTT ACTTCTCTAA TGACCGAGTT TGGATAACTT TCCGGCCCTG AGTGGTAGTT 61 GCCCACCTCT CTGGGCCAGT CCGAAAGCCT CACTGAGCCA TTCAATCGGT AGTAGCGACG 121 GGCGGTGTGT ACAAAGGGCA GGGACGTAAT CAACGCAAGC TGATGACTTG CGCTTACTAG 181 GGATTCCTCG TTGAAGAGCA ATAATTGCAA TGCTCTATCC CCAGCACGAC GGAGTTTAAC 241 AAGATTACCC GGGCCTTCCG GCCAAGGGAG TACTCGCTGG CTCCGTCAGT GTAACGCGCG
301TGCGGCCCAG AACATCTAAG GGCATCACAG ACCTGTTATT GCCTCAAACT TCCATCGGCT361 TGAGCCGATA GTCCCTCTAA GAAGCCGGCG TACTGCCAAA GCAATACGGG CTATTTAGCA421 GGTTAAGGTC TCGTTCGTTA TCGCAATTAA GCAGACAAAT CACTCCACCA ACTAAGAACG481 GCCATGCACC ACCACCCACA AAATCAAGAA AGAGCTCTCA ATCTGTCAAT CCTCATTGTG541 TCTGGACCTG GTGAGTTTCC CCGTGTTGAG TCAAATTAAG CCGCAGGCTC CACCCCTGGT601 GGTGCCCTTC CGTCAATTTC TTTAAGTTTC AGCCTTGCGA CCATACTCCC CCTGGAGCCC661 AAGCACTTTG ATTTCTCGTA AGGTGTCGAA CGAGTCAAAA AATAACATCG TCCGATCCCT721 AGTCGGCATA GTTTATGGTT AAGACTACGA CGGTATCTGA TCGTCTTCGA TCCCCTAACT781 TTCGTTCCTG ATAAATGAAA ACATCCTTGG CAAATGCTTT CGCAGTAGTT AGTCTTCAAT841 AAATCCAAGA ATTTCACCTC TGACAATTGA ATACTGATGC CCCCGACTGT CCCTATTAAT901 CATTACGGCG GTCCTAGAAA CCAACAAAAT AGAACCACAC GTCCTATTCT ATTATTCCAT961 GCTAATGTAT TCGAGCATAG GCCTGCCTGG AGCACTCTAA TTTTTTCAAA GTAAAAGTCC1021 TGTTTCCCCG GCACACCCAG TGAAGGGCAT GCGGTTCCAC AGAGGGAAAG GCCCGGCCGG1081 ACCAGTGCAC GCGGTGAGGC GGACCGGCCA GCCAGGCCCA AGGTTCTACT ACGAGCTTTT1141 TAACCACAAC AACTTTAATA TACGCTATTG GAGCTGGAAT TACCGCGGCT GCTGGCACCA1201 GACTTGCCCT CCAATTGTTC CTCGTTAAGG GATTTAAATT GTACTCATTC CAATTACAAG1261 ACCCAAAAGA GCCCTGTATC AGTATTTATC GTCACTACCT CCCCGTGTCG GGATTGGGTA1321 ATTTGCGCGC CT GCTGCCTT CCTTGGATGT AGTAGCCGTT TCTCAGGCTC CTTCTCCGGG1381 GTCGAGCCCT AACCCTCCGT TACCCGTTGT AACCATGCTA GAACACTACT CTAGCATCGA1441 AAGTTGATAG GGAAGAAATT TGAATGAACC ATCGCCGGCG CAAGGCCATG CGATTCGAGA1501 AGTTATTATG AATCACCAGT GAGCCCCGAA GGGCATTGGT TTTTAATCTA ATAAATACAT1561 CCCTTCCGAA GTCGGGATTT TTAGCATGTA TTAGCTCTAG AATTACCACG GTTATCCAAG1621 TAGTAAGGTA CTATCAAATA AACGATAACT TATATAATGA GCCATTCGCA GTTTCGCTGT1681 ATAATGCTTA TACTTAGACA TGCATGGGCT TAATCTTTTT AGACAGCCTA TGACTACCAT1741 CGTTCGAAAG GCAGGCGGTG CAAAACATGG GCGITS基因序列如下
I TTAAGTTCAG CGGGTATTCC TACCTGATCC GAGGTCAACC TGTAAAAGTT TTGGGGGTTT 61 TACGGCAAGA GTCCCTCCGG ATCCCAGTGC GAGACGTTAA GTTACTACGC AAAGGAGGCT 121 CCGGGAGGGT CCGCCACTAC CTTTAAGGGC CTACGTCGAC CGTAGGGCCC CAACACCAAG 181 CCGGGCTTGA GGGTTGAAAT GACGCTCGAA CAGGCATGCC CGCCAGAATG CTGGCGGGCG 241 CAATGTGCGT TCAAAGATTC GATGATTCAC TGAATTCTGC AATTCACATT ACTTATCGCA 301 TTTCGCTGCG TTCTTCATCG ATGCCAGAAC CAAGAGATCC GTTGTTAAAA GTTTTAATTA 361 TTTGCTTGTG CCACTCAGAA GAAACGTCGT TAAAATAGAG TTTGGTATCC TCCGGCGGGC 421 GCCACGCCCG TGAGGGCGCG GCCGGGAGGG GGACCGCCCC CCCGAGGGGG GGTTGTCCTC 481 CTGCCCGCCG AAGCAACAGT TAAGGTATGT TCACAAAGGG TTGTAGAGCG GTAACTCAGT 541 AATGATCCCT CCGCAGGTTC ACCTACGGA
本发明运用全波长扫描和比浊法确定孢子数量首先过滤培养至对数期末期的培养液得到孢子悬液，离心后弃上清，无菌水重新悬浮，全波长扫描确定在455 nm下有最大最大吸收峰，然后将孢子悬液浓度稀释为IX 106、2X 106、3X 106、4X 106、5X 106、7X 106、8X 106，然后测定不同浓度的孢子悬液在450 nm下的吸光值，建立亚麻刺盘孢对数期末期孢子数目与OD值的回归方程Y=5. 637Χ 10_2 + 7. 216X IO^8X (P < O. 01)。使用比浊法计数真菌孢子时将测得的OD值代入方程便可快速、准确得出孢子数目。此方法大大减少了工作步骤，提高了工作效率。 本发明运用一种酮康唑抗性筛选法对诱变后的菌株进行初筛
酮康唑为咪唑类抗真菌药，其作用机制为抑制真菌细胞膜麦角留醇的生物合成，影响细胞膜的通透性，抑制其生长。它的作用机制主要为高度选择性干扰真菌的细胞色素Ρ-450的活性，从而抑制真菌细胞膜上麦角固醇的生物合成。酮康唑最低抑菌浓度的确定
首先制作孢子悬液，然后将孢子悬液稀释到合适的倍数涂布于酮康唑梯度平板上，30°C培养3天，平板菌落计数。未生长菌落的最低酮康唑浓度为最低抑菌浓度。本发明首次对亚麻刺盘孢进行复合诱变
对出发菌株进行紫外诱变和氮离子注入诱变，结合酮康唑抗性进行初筛，挑取含有酮康唑最低抑菌浓度平板上生长良好的菌落接种于种子培养基培养3 4天，待种子液生长为肉眼可见的均匀小球时以10 %的接种量转接种子培养基培养24 h，然后以10 %的接种量接种发酵培养基，培养至24 h时10 g/L DHEA投料，转化至72 h停止发酵，取样乙酸乙酯萃取，TLC、HPLC检测发酵产物。所述培养基组成种子培养基(g/U :花生饼粉 I %，葡萄糖1. 5 %，KCl 0.1 %，(NH4) SO4 0. 2 %，MgSO4
0.15 %
K2H2PO4 0.1 % ;去离子水定容；PH 7. 0 ；
发酵培养基(g/L):淀粉2 %，酵母膏1. 5 %，葡萄糖2 %，麦芽膏I %，泡敌0. 15 % ;去离子水定容；PH 7. 0 ；
本发明首次通过复合诱变亚麻刺盘孢，得到高底物投料量、高底物转化率、高产物得率的菌株随机挑取酮康唑平板上生长良好的单菌落接种种子培养基，两次活化后，以10 %的接种量接种发酵培养基，进行摇瓶复筛，72 h终止发酵，TLC、HPLC定性定量检测产物。通过复合诱变，投料10 g/L时，底物转化率由原来的49. 6 %提高到83. 2%，产物得率由原来的38. 3 %提高到62. 3%，产物得率和底物转化率都有较大幅度的提高。
图1 菌株{Colletotrichum Iini ST-1, CGMCC No. 6051)的 PDA 平板菌落形态。图2 菌株(PoIletotrichum Iini ST-1, CGMCC No. 6051)的菌丝和抱子形态。图3 菌株{Colletotrichum Iini ST-1, CGMCC No. 6051)底物 10g/L 的发酵过程曲线。图4 MHCoIletotrichum Iini ST-1, CGMCC No. 6051)发酵产物的 HPLC 图谱。
具体实施例方式实施实例1:出发菌株的选择、生长曲线、转化曲线和转化能力的测定 出发菌株的选择
将已有斜面菌株划线分离单菌落，挑取平板上100株生长良好的单菌落，接种于种子培养基，30 0C >200 r/min培养4 5天后以10 %的接种量二次转接于种子培养基，培养20 30 h后以10 %的接种量接种于250 mL摇瓶，30 °C >200 r/min培养24 h后以10 g/L DHEA投料，28 °C >200 r/min发酵72 h后终止发酵，取样乙酸乙酯萃取3 4次，TLC初步检测底物转化和产物生成状况，HPLC定性、定量检测底物转化和产物生成。选择一株底物转化率和产物得率相对较高的菌株做为出发菌株。出发菌株生长曲线的测定
以10 %的接种量接种于500mL摇瓶(装液量100 mL)，30 °C>200 r/min培养，每隔4h取样I mL，烘干称干重(连续称重三次，重量差别不超过0.5 %)，以时间为横坐标(0 90
h)，以菌体干重为纵坐标做菌体生长曲线。出发菌株转化曲线和转化能力的测定
以10%的接种量接种于500mL摇瓶(装液量100 mL)，28 °C >200 r/min培养至24 h分
别以4 g/L,8 g/L、10 g/L、12 g/L、16 g/L投料，投料后每间隔4 8 h取样，乙酸乙酯萃
取3 4次，HPLC检测底物转化和产物生成状况，以时间(h)为横坐标，产物生成量和底物
剩余量(g/L)为纵坐标做菌株转化曲线。
权利要求
1.一株通过复合诱变筛选得到的高效转化去氢表雄酮为30，7a，15a-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的突变菌株,该菌株为亚麻刺盘孢Iini ) ST-1,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 6051，保藏日期为2012年4月24日。
2.亚麻刺盘孢(Cb77e(otricA7i/ i)ST_l保藏号CGMCCNo. 6051的诱变选育方法，其特征在于 (1)出发菌株的确定将已有斜面菌种平板划线分离单菌落，随机挑选生长良好的100株单菌落摇瓶发酵，TLC、HPLC检测底物转化和产物生成能力，最终选择C I为出发菌株； (2)孢子悬液的制备菌液培养至对数期2 4层无菌擦镜纸过滤得到孢子悬液，10000r/min离心10 min,弃上清后0. 9 %无菌生理盐水洗剂2 3次后，振荡打散； (3)孢子计数方法的确定孢子悬液全波长扫描确定最大吸收波长为455nm，然后将孢子悬液浓度分别调整为IX 106、2X 106、3X 106、4X 106、5X 106、7X 106、8X 106，然后测定不同浓度的孢子悬液在450 nm下的吸光值，建立亚麻刺盘孢对数期末期孢子数目与OD值的回归方程Y=5. 637X 10_2 + 7. 216X 10_8 X (P < 0.01);使用比浊法计数真菌孢子时将测得的OD值代入方程便可快速、准确得出孢子数目； (4)出发菌株生长曲线、紫外致死率曲线和N-离子注入致死率曲线的制定接种后每隔4 h取样测干重，以时间为横坐标，菌体干重为纵坐标做菌体生长曲线；诱变孢子悬液至于 25 w、30 cm 紫夕卜灯下分别照身寸 I min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min、8 min,稀释涂布PDA平板，选择80 % 90 %的致死率照射时间进行诱变；取诱变孢子悬液0.1 ml均匀涂布于直径为90 _的无菌空白平皿中央，至于超净台下由无菌风吹干制成菌膜，注入前靶室用紫外灯灭菌30 min，将孢子悬液放于靶室，分别用2. 6X1014 ions/cm2的0、20、40、60、80、100、120和140倍的不同剂量注入离子；将诱变孢子适当稀释，涂布PDA平板，以置于小靶室真空中不经离子注入的孢子悬液为对照，计算存活率，做致死率曲线；选择70% 80 %的致死率注入剂量作为最佳注入剂量； (5)使用酮康唑抗性对诱变菌株初筛首先确定酮康唑最低抑菌浓度，孢子悬液涂布于酮康唑梯度平板，未生长菌落的酮康唑平板浓度即为最低抑菌浓度；诱变后涂布菌悬液与含有酮康唑最低抑菌浓度的PDA平板，30 °C培养3 4天，挑取生长良好的单菌落摇瓶复筛。
3.利用突变株亚麻刺盘孢Iini)ST-1保藏号CGMCC No. 6051转化去氢表雄酮为30，7a，15a-三羟基雄甾_5_烯_17_酮的方法，其特征为250 mL三角瓶装30 mL的种子培养基，接种量按体积比为10 %，培养温度30 °C，摇床转速200 r/min，培养24 h后投入底物去氢表雄酮，继续转化60 72 h，乙酸乙酯萃取，TLC、HPLC检测底物转化和产物生成；所述培养基组成种子培养基(g/L):花生饼粉I %，葡萄糖1. 5 %，KCl 0.1%，(NH4) SO4 0. 2 %，MgSO4 0. 15 %，K2H2PO4 0.1 % ;去离子水定容；PH 7. 0 ;发酵培养基(g/L)淀粉2 %，酵母膏1. 5 %，葡 萄糖2 %，麦芽膏I %，泡敌0. 15 % ;去离子水定容；PH 7. 0 ；.121 "€高压蒸汽下灭菌20 min。
全文摘要
本发明属生物工程中发酵技术领域，具体涉及通过紫外和氮离子注入复合诱变筛选得到高效转化去氢表雄酮为3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的高产突变株(Colletotrichumlini)ST-1。本发明通过紫外线和氮离子注入复合诱变，获得底物投料浓度高、转化率高、副产物较少的菌株，为微生物转化甾体药物工业化提供了基础。
文档编号C12P33/06GK103060201SQ20121042772
公开日2013年4月24日 申请日期2012年11月1日 优先权日2012年11月1日
发明者许正宏, 李传鹏, 李会, 史劲松, 窦文芳 申请人:江南大学