专利名称：诱导的多潜能干细胞分化为软骨细胞的方法
诱导的多潜能干细胞分化为软骨细胞的方法技术领域
本发明属于细胞组织工程领域，具体涉及一种诱导的多潜能干细胞分化为软骨细胞的方法。
背景技术：
创伤和骨性关节炎等疾病引起的关节软骨损伤和退行性疾病依然是全球范围内威胁健康的主要问题之一。尽管手术或非手术措施进行干预治疗方面进展很快，但软骨损伤的修复仍然是十分棘手的问题。近年来，组织工程技术的出现为软骨缺损的修复带来了曙光，而种子细胞则是其中的一个重要因素。目前，胚胎干细胞和间充质干细胞均被应用于软骨组织工程研究，但胚胎干细胞存在来源受限、面临伦理学正义等问题，并且具有较强的免疫原性，而间充质干细胞则因为数量不足、分化能力有限等问题限制了其应用。因此，寻找更佳来源的种子细胞已成为组织工程软骨研究应用的关键。
2006年，日本科学家Yamanaka等首次将小鼠成纤维细胞通过基因重编程的方式诱导为诱导的多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS干细胞),并于2012 年获得诺贝尔医学或生理学奖。这种细胞因其兼具自我更新和全能分化潜能，同时弥补了胚胎干细胞面临的伦理学争论和异体排斥反应的缺陷，是理想的组织工程种子细胞。目前， 通过对iPS干细胞进行体外诱导和人工操作，科学家们正致力于实现对某些损伤性和退行性变性疾病的细胞替代治疗。
美国专利US2011229440-A1曾报道iPS干细胞具有向软骨细胞分化的潜能，但其采用骨形态发生蛋白(bone morphogenelic proteins, BMPs)作为诱导剂,价格昂贵,且操作系统重复性较差，诱导体系过于复杂，因此，需要开发全新的方法，将诱导的多潜能干细胞(iPS干细胞)分化为全功能的软骨细胞。发明内容
本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种制作容易，简便易行诱导的多潜能干细胞(iPS干细胞)分化为软骨细胞的方法，本发明的目的通过下述方案来实现，本发明包括细胞制备，培养基配制，其特征在于按下列步骤进行1、原代胚胎鼠成纤维细胞的制备，取孕13-14天母鼠子宫中的胎鼠，无菌条件下，将胎鼠去头和内脏后剪成糊状,再经胰蛋白酶消化,收集细胞,接种到含有10%胎牛血清的DMEM 培养液的细胞培养瓶中贴壁培养2— 3天；2、饲养层细胞的制备，复苏冻存的胚胎鼠成纤维细胞，接种到细胞培养瓶中，待细胞有 80% — 90%融合时，用丝裂霉素C处理，胰蛋白酶消化，在含有10%胎牛血清的DMEM培养液里培养成细胞悬液，计数，按IO5个/cm2细胞密度接种到0. 08—0. 12%明胶包被的培养皿中贴壁培养至密度为50— 60%汇合为宜，备用；3、诱导的多潜能干细胞的未分化扩增培养，复苏冻存的诱导的多潜能干细胞接种到经丝裂霉素C处理的饲养层上，在诱导的多潜能干细胞培养基中培养，所说的多潜能干细胞培养基以高糖DMEM为基础，添加18 — 22%胎牛血清、O. 8—1. 2%非必需氨基酸、O. 08— O. 12mmol/L 巯基乙醇、I. 8—2. 2mmol/L 谷氨酰胺、48— 54U/ml 青霉素、48— 54U/ml 链霉素、950—1100U/ml LIF ；4、细胞微团的获取，诱导的多潜能干细胞经胰酶消化、离心，调成IXlOVml的细胞重悬液，取20μ1 (2. O X IO5个细胞)转移到含I. Oml培养基的离心管中，离心，弃上清；所说的培养基为含5 —10%胎牛血清的DMEM培养基。
5、软骨细胞的获取，配置软骨细胞诱导培养基在DMEM培养基中加入5 —10%胎牛血清、6—6. 5 μ g/ml胰岛素、10—20ng/ml转化生长因子β 1、95—110 μ mol/ml地塞米松、 37一38mg/ml 抗坏血酸、O. 8一I. 2 μ mol/ml 丙酮酸钠、6—6. 5 μ g/ml 转铁蛋白；6、成软骨细胞诱导将配置好的成软骨细胞诱导培养基缓慢加入含有细胞微团的离心管中，诱导培养20— 23天，每2— 3天半量更换诱导培养液。
本发明的优点在于本发明工艺先进简单，无需专门的仪器设备，只要掌握细胞培养的基本操作规则，简便易行；本发明可以在短时间内一次诱导产生大量软骨细胞，通过细胞微团三维立体培养将少了常规贴壁静态培养中由于传代次数增加而造成的细胞多向分化潜力丢失，降低了污染的几率，减少了细胞损伤。本发明提供了一种诱导的多潜能干细胞向软骨细胞分化的方法，经本发明方法的诱导，诱导的多潜能干细胞在体外可分化为软骨细胞，所产生的软骨细胞可用于体内移植治疗软骨组织缺损或为组织工程软骨研究提供充足的种子细胞来源。
图I显示体外培养21天后诱导的多潜能干细胞微团番红快绿染色结果；左为对照组，右为诱导组；图2显示体外培养21天后诱导的多潜能干细胞微团免疫组化染色结果；左为对照组， 右为诱导组。
具体实施方式
实施例I :(O原代胚胎鼠成纤维细胞的准备在无菌条件下，取孕13—14天BABL/C小鼠的胎鼠，去除胚胎头和内脏，用眼科剪将胎鼠剪碎成糊状，置于O. 25%胰酶中，37°C水浴消化15分钟，将上层细胞悬液倒入IOml离心管，1000r/min离心5分钟，收集细胞，获得的细胞用10%胎牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液，以IX IO6的密度接种到IOOmm培养皿中，在37°C，5% CO2的孵箱中培养，约2—3天后细胞长满，可收集细胞冻存于液氮中。所说的高糖DEME培养基为已公开的培养基组成，可采用市售产品，如Gibco或Sigma公司的产品。
(2)饲养层细胞的制备复苏步骤I制备的胚胎鼠成纤维细胞，用含10%胎牛血清的DMEM制成细胞悬液，IX IO6 的密度接种到IOOmm培养皿中，在37°C，5% CO2的孵箱中培养，当细胞80% — 90%融合时，用丝裂霉素C处理，即用含10 μ g/ml丝裂霉素C和10%胎牛血清的DMEM培养液37°C孵育2— 3小时，然后吸除丝裂霉素C，胰酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液，按IO5个/cm2的细胞密度接种到O. 08%(重量百分比)明胶包被的培养皿中，在37°C，5% CO2 的孵箱中培养，饲养层细胞的密度以50% — 60%汇合为宜。
(3)诱导的多潜能干细胞的未分化扩增培养无菌条件下取冻存的小鼠诱导的多潜能干细胞接种到步骤2制备的饲养层细胞上，在含20%胎牛血清(v/v)、l. 2非必需氨基酸(v/v)、l. Ommol/L巯基乙醇、I. 8mmol/L谷氨酰胺、50U/ml青霉素、48U/ml链霉素、1100U/ml LIF的DMEM培养基中培养扩增，所说的非必需氨基酸为已公开的成分，可采用市售产品如Hyclone等。
(4)细胞微团的获取无菌条件下，将步骤3培养的小鼠诱导的多潜能干细胞经胰酶消化，1000r/min离心5 分钟，收集细胞，获得的细胞用5 —10%胎牛血清的DMEM培养基调成I X 107/ml的细胞重悬液。取其中20μ1 (2. OX IO5个细胞)转移到含1.0ml 5 —10%胎牛血清的DMEM培养基的 15ml离心管中，离心，弃上清，获得细胞微团。
5、软骨细胞的获取向含有细胞微团的离心管每管加入Iml诱导培养液(含5%胎牛血清、6. 5 μ g/ml胰岛素、15ng/ml转化生长因子β I、100 μ mol/ml地塞米松、38mg/ml抗坏血酸、I. O μ mol/ml丙酮酸钠、6. 25 μ g/ml转铁蛋白的DMEM培养液)，持续诱导20-23天即为软骨细胞，诱导分化的软骨细胞大多悬浮或半悬浮，可通过离心法更换诱导培养液，每2-3天半量更换诱导培养液。
6、软骨细胞的鉴定(I)番红快绿染色将已诱导3周的细胞微团弃去诱导液，用固定液(4%多聚甲醛)固定过夜，石蜡包埋，切片，石蜡切片经常规脱蜡脱水处理、苏木素染色3分钟，PBS冲洗后，快绿染色5分钟，盐酸酒精分化观察颜色变化(短于2秒)，PBS冲洗，番红染色3分钟，PBS冲洗后，梯度酒精脱水， 晾干，封片镜检。
番红快绿染色鉴定方法定向诱导后的细胞经番红快绿染色后成红色，表明诱导的多潜能干细胞分化为软骨细胞，并且分泌细胞外基质，呈阳性反应(见图I)。
(2)免疫组化II型胶原鉴定将已诱导3周的细胞微团弃去诱导液，用固定液(4%多聚甲醛)固定过夜，石蜡包埋，切片。石蜡切片经常规脱蜡脱水处理后2%透明质酸酶25°C孵育30分钟，PBS冲洗，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶10分钟，加入封闭液室温30分钟，加入II型胶原单克隆抗体， 室温孵育I小时，PBS冲洗，加入二抗，室温I小时，PBS冲洗后，DAB显色，晾干，镜检。
免疫组化II型胶原鉴定结果定向诱导后的细胞经免疫组化染色后成棕褐色，表明诱导的多潜能干细胞分化为软骨细胞，并且分泌II型胶原，呈阳性反应见图2)。
实施例2:(O原代胚胎鼠成纤维细胞的准备在无菌条件下，取孕13—14天BABL/C小鼠的胎鼠，去除胚胎头和内脏，用眼科剪将胎鼠剪碎成糊状，置于0. 25%胰酶中，37°C水浴消化15分钟，将上层细胞悬液倒入IOml离心管，1000r/min离心5分钟，收集细胞，获得的细胞用10%胎牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液，以IX IO6的密度接种到IOOmm培养皿中，在37°C，5% CO2的孵箱中培养，约2—3天后细胞长满，可收集细胞冻存于液氮中。所说的高糖DEME培养基为已公开的培养基组成，可采用市售产品，如Gibco或Sigma公司的产品。
(2)饲养层细胞的制备复苏步骤I制备的胚胎鼠成纤维细胞，用含10%胎牛血清的DMEM制成细胞悬液，IX IO6 的密度接种到IOOmm培养皿中，在37°C，5% CO2的孵箱中培养，当细胞80% — 90%融合时，用丝裂霉素C处理，即用含10 μ g/ml丝裂霉素C和10%胎牛血清的DMEM培养液37°C孵育2— 3小时，然后吸除丝裂霉素C，胰酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液， 按IO5个/cm2的细胞密度接种到O. 1% (重量百分比)明胶包被的培养皿中，在37°C，5% CO2 的孵箱中培养，饲养层细胞的密度以50% — 60%汇合为宜。
(3)诱导的多潜能干细胞的未分化扩增培养无菌条件下取冻存的小鼠诱导的多潜能干细胞接种到步骤2制备的饲养层细胞上，在含18%胎牛血清(v/v)、l. O非必需氨基酸(v/v)、0. 08mmol/L巯基乙醇、2. Ommol/L谷氨酰胺、48U/ml青霉素、54U/ml链霉素、1000U/ml LIF的DMEM培养基中培养扩增，所说的非必需氨基酸为已公开的成分，可采用市售产品如Hyclone等。
(4)细胞微团的获取无菌条件下，将步骤3培养的小鼠诱导的多潜能干细胞经胰酶消化，1000r/min离心5 分钟，收集细胞，获得的细胞用5 —10%胎牛血清的DMEM培养基调成I X 107/ml的细胞重悬液。取其中20μ1 (2. OX IO5个细胞)转移到含1.0ml 5 —10%胎牛血清的DMEM培养基的 15ml离心管中，离心，弃上清，获得细胞微团。
5、软骨细胞的获取向含有细胞微团的离心管每管加入Iml诱导培养液(含10%胎牛血清、6. 5 μ g/ml胰岛素、10ng/ml转化生长因子β I、110 μ mol/ml地塞米松、37mg/ml抗坏血酸、I. 2 μ mol/ml丙酮酸钠、6 μ g/ml转铁蛋白的DMEM培养液)，持续诱导20— 23天即为软骨细胞，诱导分化的软骨细胞大多悬浮或半悬浮，可通过离心法更换诱导培养液，每2-3天半量更换诱导培养液。
其余同实施例I。
实施例3 (O原代胚胎鼠成纤维细胞的准备在无菌条件下，取孕13—14天BABL/C小鼠的胎鼠，去除胚胎头和内脏，用眼科剪将胎鼠剪碎成糊状，置于O. 25%胰酶中，37°C水浴消化15分钟，将上层细胞悬液倒入IOml离心管，1000r/min离心5分钟，收集细胞，获得的细胞用10%胎牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液，以IX IO6的密度接种到IOOmm培养皿中，在37°C，5% CO2的孵箱中培养，约2—3天后细胞长满，可收集细胞冻存于液氮中。所说的高糖DEME培养基为已公开的培养基组成，可采用市售产品，如Gibco或Sigma公司的产品。
(2)饲养层细胞的制备复苏步骤I制备的胚胎鼠成纤维细胞，用含10%胎牛血清的DMEM制成细胞悬液，IX IO6 的密度接种到IOOmm培养皿中，在37°C，5% CO2的孵箱中培养，当细胞80% — 90%融合时，用丝裂霉素C处理，即用含10 μ g/ml丝裂霉素C和10%胎牛血清的DMEM培养液37°C孵育2— 3小时，然后吸除丝裂霉素C，胰酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液，按IO5个/cm2的细胞密度接种到O. 12%(重量百分比)明胶包被的培养皿中，在37°C，5% CO2 的孵箱中培养，饲养层细胞的密度以50% — 60%汇合为宜。
(3)诱导的多潜能干细胞的未分化扩增培养无菌条件下取冻存的小鼠诱导的多潜能干细胞接种到步骤2制备的饲养层细胞上，在含22%胎牛血清(ν/ν)、0. 8非必需氨基酸(v/v)、0. 12mmol/L巯基乙醇、2. 2mmol/L谷氨酰胺、54U/ml青霉素、50U/ml链霉素、950U/ml LIF的DMEM培养基中培养扩增，所说的非必需氨基酸为已公开的成分，可采用市售产品如Hyclone等。
(4)细胞微团的获取无菌条件下，将步骤3培养的小鼠诱导的多潜能干细胞经胰酶消化，1000r/min离心5 分钟，收集细胞，获得的细胞用5 —10%胎牛血清的DMEM培养基调成I X 107/ml的细胞重悬液。取其中20μ1 (2. OXlO5个细胞)转移到含I. Oml 8%胎牛血清的DMEM培养基的15ml 离心管中，离心，弃上清，获得细胞微团。
5、软骨细胞的获取向含有细胞微团的离心管每管加入Iml诱导培养液(含8%胎牛血清、6. 25 μ g/ml胰岛素、20ng/ml转化生长因子β 1、95 μ mol/ml地塞米松、37. 5mg/ml抗坏血酸、O. 8 μ mol/ml丙酮酸钠、6. 5 μ g/ml转铁蛋白的DMEM培养液)，持续诱导20— 23天即为软骨细胞，诱导分化的软骨细胞大多悬浮或半悬浮，可通过离心法更换诱导培养液，每2-3天半量更换诱导培养液。
其余同实施例I。
权利要求
1.一种诱导的多潜能干细胞分化为软骨细胞的方法，包括细胞制备，培养基配制，其特征在于按下列步骤进行 (1)原代胚胎鼠成纤维细胞的制备，取孕13—14天母鼠子宫中的胎鼠，无菌条件下，将胎鼠去头和内脏后剪成糊状，再经胰蛋白酶消化，收集细胞，接种到含有10%胎牛血清的DMEM培养液的细胞培养瓶中 贴壁培养2— 3天； (2)饲养层细胞的制备，复苏冻存的胚胎鼠成纤维细胞，接种到细胞培养瓶中，待细胞有80% — 90%融合时，用丝裂霉素C处理，胰蛋白酶消化，在含有10%胎牛血清的DMEM培养液里培养成细胞悬液，计数，按IO5个/cm2细胞密度接种到O. 08—0. 12%明胶包被的培养皿中贴壁培养至密度为50— 60%汇合为宜，备用； (3)诱导的多潜能干细胞的未分化扩增培养，复苏冻存的诱导的多潜能干细胞接种到经丝裂霉素C处理的饲养层上，在诱导的多潜能干细胞培养基中培养，所说的多潜能干细胞培养基以高糖DMEM为基础，添加18 — 22%胎牛血清、O. 8—1. 2%非必需氨基酸、O. 08—O. 12mmol/L 巯基乙醇、I. 8—2. 2mmol/L 谷氨酰胺、48— 54U/ml 青霉素、48— 54U/ml 链霉素、950—1100U/ml LIF ； (4)细胞微团的获取，诱导的多潜能干细胞经胰酶消化、离心，调成IXlOVml的细胞重悬液，取20μ1 (2. OX IO5个细胞)转移到含I. Oml培养基的离心管中，离心，弃上清，所说的培养基为含5 —10%体积百分比胎牛血清的DMEM ； (5)软骨细胞的获取，配置软骨细胞诱导培养基在DMEM培养基中加入5—10%胎牛血清、6—6. 5 μ g/ml胰岛素、10—20ng/ml转化生长因子β 1、95—110 μ mol/ml地塞米松，37一38mg/ml 抗坏血酸、O. 8一I. 2 μ mol/ml 丙酮酸钠、6—6. 5 μ g/ml 转铁蛋白； (6)成软骨细胞诱导将配置好的成软骨细胞诱导培养基缓慢加入含有细胞微团的离心管中，诱导培养20— 23天，每2天半量更换诱导培养液。
全文摘要
本发明公开了一种诱导的多潜能干细胞(iPS干细胞)分化为软骨细胞的方法，其特征是诱导的多潜能干细胞以细胞微团的方式，利用条件培养液进行诱导培养，所属培养液为DMEM高糖培养基中含有5—10%胎牛血清、6—6.5μg/ml胰岛素、10—20ng/ml转化生长因子β1、95—110μmol/ml地塞米松、37—38mg/ml抗坏血酸、0.8—1.2μmol/ml丙酮酸钠、6—6.5μg/ml转铁蛋白。本发明工艺先进，操作简单，可重复性强，为实施细胞替代疗法，最终实现组织器官的再生和替换提供可能，并藉此希望找到一条大规模生产所需细胞平台的途径，进而为发育生物学、医学、遗传学领域开拓一个崭新的研究前景。
文档编号C12N5/077GK102925408SQ20121042688
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者冯刚, 刘康, 陈竹 申请人:川北医学院第二临床医学院